Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es un método para separar una biomolécula de una mezcla, basado en una interacción de unión macromolecular altamente específica entre la biomolécula y otra sustancia. El tipo específico de interacción de unión depende de la biomolécula de interés; Las interacciones de unión de antígeno y anticuerpo , enzima y sustrato , receptor y ligando , o proteína y ácido nucleico ^[1] se explotan con frecuencia para el aislamiento de diversas biomoléculas. La cromatografía de afinidad es útil por su alta selectividad y resolución.de separación, ^{[2] [3] en} comparación con otros métodos cromatográficos.

Principio

La cromatografía de afinidad aprovecha las interacciones de unión específicas entre el analito de interés (normalmente disuelto en la fase móvil ) y una pareja de unión o ligando (inmovilizado en la fase estacionaria ). En un experimento típico de cromatografía de afinidad, el ligando se une a una matriz sólida e insoluble, generalmente un polímero como agarosa o poliacrilamida, modificado químicamente para introducir grupos funcionales reactivos con los que el ligando puede reaccionar, formando enlaces covalentes estables. ^[4] La fase estacionaria se carga primero en una columna en la que se introduce la fase móvil. Las moléculas que se unen al ligando permanecerán asociadas con la fase estacionaria. A continuación, se aplica un tampón de lavado para eliminar las biomoléculas no objetivo interrumpiendo sus interacciones más débiles con la fase estacionaria, mientras que las biomoléculas de interés permanecerán unidas. Las biomoléculas diana se pueden eliminar aplicando un tampón de elución, que interrumpe las interacciones entre las biomoléculas diana unidas y el ligando. Por tanto, la molécula diana se recupera en la solución de elución. ^[5]

La cromatografía de afinidad no requiere que se conozcan el peso molecular, la carga, la hidrofobicidad u otras propiedades físicas del analito de interés, aunque el conocimiento de sus propiedades de unión es útil en el diseño de un protocolo de separación. ^{[5] Los} tipos de interacciones de unión comúnmente explotadas en los procedimientos de cromatografía de afinidad se resumen en la tabla siguiente.

Interacciones biológicas típicas utilizadas en cromatografía de afinidad ^[6]

No Señor	Tipos de ligando	Molécula objetivo
1	Sustrato análogo	Enzimas
2	Anticuerpo	Antígeno
3	Lectina	Polisacárido
4	Ácido nucleico	Secuencia de bases complementaria
5	Hormona	Receptor
6	Avidina	Biotina / Molécula conjugada con biotina
7	Calmodulina	Compañero de unión a la calmodulina
8	Glutatión	Proteína de fusión GST
9	Proteínas A y G	Inmunoglobulinas
10	Iones de metal	Proteína de fusión de poli-histidina

Configuraciones de lote y columna

Cromatografía de columna

Cromatografía por lotes

La unión a la fase sólida se puede lograr mediante cromatografía en columna mediante la cual el medio sólido se empaqueta en una columna, la mezcla inicial se pasa a través de la columna para permitir la sedimentación, se pasa un tampón de lavado a través de la columna y el tampón de elución se aplica posteriormente a la columna y se recoge. . Estos pasos generalmente se realizan a presión ambiental. Alternativamente, la unión se puede lograr usando un tratamiento por lotes, por ejemplo, agregando la mezcla inicial a la fase sólida en un recipiente, mezclando, separando la fase sólida, eliminando la fase líquida, lavando, volviendo a centrifugar, agregando el tampón de elución, volver a centrifugar y retirar el eluido.

A veces se emplea un método híbrido de modo que la unión se realiza mediante el método discontinuo, pero la fase sólida con la molécula diana unida se empaqueta en una columna y el lavado y elución se realizan en la columna.

Los ligandos utilizados en la cromatografía de afinidad se obtienen de fuentes tanto orgánicas como inorgánicas. Ejemplos de fuentes biológicas son proteínas séricas, lectinas y anticuerpos. Fuentes inorgánicas como actos morónicos, quelatos de metales y tintes de triazina. ^[7]

También se ha desarrollado un tercer método, la absorción en lecho expandido, que combina las ventajas de los dos métodos mencionados anteriormente. Las partículas de fase sólida se colocan en una columna donde la fase líquida se bombea desde la parte inferior y sale por la parte superior. La gravedad de las partículas asegura que la fase sólida no salga de la columna con la fase líquida.

Las columnas de afinidad se pueden eluir cambiando las concentraciones de sal, pH, pI, carga y fuerza iónica directamente o mediante un gradiente para resolver las partículas de interés.

Más recientemente, se han desarrollado configuraciones que emplean más de una columna en serie. La ventaja en comparación con las configuraciones de una sola columna es que el material de resina se puede cargar por completo, ya que el producto no ligante se pasa directamente a una columna consecutiva con material de columna nuevo. Estos procesos cromatográficos se conocen como cromatografía periódica en contracorriente (PCC). Por tanto, los costes de resina por cantidad de producto producido pueden reducirse drásticamente. Dado que una columna siempre se puede eluir y regenerar mientras se carga la otra columna, ya son suficientes dos columnas para aprovechar al máximo las ventajas. ^[8] Las columnas adicionales pueden brindar flexibilidad adicional para los tiempos de elución y regeneración, a costa de equipos adicionales y costos de resina.

Usos específicos

La cromatografía de afinidad se puede utilizar en varias aplicaciones, incluida la purificación de ácidos nucleicos, la purificación de proteínas ^{[9] a} partir de extractos libres de células y la purificación de sangre.

Mediante el uso de la cromatografía de afinidad, se pueden separar las proteínas que se unen a un determinado fragmento de las proteínas que no se unen a ese fragmento específico. ^[10] Debido a que esta técnica de purificación se basa en las propiedades biológicas de la proteína necesaria, es una técnica útil y las proteínas se pueden purificar muchas veces en un solo paso. ^[11]

Varios medios de afinidad

Existen muchos medios de afinidad diferentes para una variedad de usos posibles. ^{[12] [13] [14]} Brevemente, son (generalizados) activados / funcionalizados que funcionan como un espaciador funcional, matriz de soporte y eliminan la manipulación de reactivos tóxicos.

Los medios de aminoácidos se utilizan con una variedad de proteínas séricas, proteínas, péptidos y enzimas, así como con rRNA y dsDNA. Los medios de biotina avidina se utilizan en el proceso de purificación de biotina / avidina y sus derivados.

La unión de carbohidratos se usa con mayor frecuencia con glicoproteínas o cualquier otra sustancia que contenga carbohidratos; los carbohidratos se usan con lectinas, glicoproteínas o cualquier otra proteína metabolita de carbohidratos. El medio de ligando colorante es inespecífico pero imita sustratos biológicos y proteínas. El glutatión es útil para la separación de proteínas recombinantes marcadas con GST. La heparina es un ligando de afinidad generalizada y es más útil para la separación de proteínas de coagulación plasmática, junto con enzimas de ácidos nucleicos y lipasas.

Los medios de interacción hidrófobos se utilizan con mayor frecuencia para dirigirse a grupos carboxilo libres y proteínas.

Los medios de inmunoafinidad (que se detallan a continuación) utilizan una alta especificidad de antígenos y anticuerpos para separar; La cromatografía de afinidad por metales inmovilizados se detalla más adelante y utiliza interacciones entre iones metálicos y proteínas (generalmente etiquetadas especialmente) para separar; nucleótido / coenzima que actúa para separar deshidrogenasas, quinasas y transaminasas.

Los ácidos nucleicos funcionan para atrapar ARNm, ADN, ARNr y otros ácidos nucleicos / oligonucleótidos. El método de proteína A / G se utiliza para purificar inmunoglobulinas.

Los medios especiales están diseñados para una clase o tipo específico de proteína / coenzima; este tipo de medio solo funcionará para separar una proteína o coenzima específica.

Inmunoafinidad

Otro uso del procedimiento es la purificación por afinidad de anticuerpos del suero sanguíneo. Si se sabe que el suero contiene anticuerpos contra un antígeno específico (por ejemplo, si el suero proviene de un organismo inmunizado contra el antígeno en cuestión), entonces puede usarse para la purificación por afinidad de ese antígeno. Esto también se conoce como cromatografía de inmunoafinidad. Por ejemplo, si un organismo se inmuniza contra una proteína de fusión GST, producirá anticuerpos contra la proteína de fusión y posiblemente también anticuerpos contra la etiqueta GST. La proteína puede luego acoplarse covalentemente a un soporte sólido tal como agarosa y usarse como ligando de afinidad en purificaciones de anticuerpos a partir de suero inmune.

Para mayor rigor, la proteína GST y la proteína de fusión GST se pueden acoplar cada una por separado. Inicialmente, se permite que el suero se una a la matriz de afinidad de GST. Esto eliminará los anticuerpos contra la parte GST de la proteína de fusión. A continuación, el suero se separa del soporte sólido y se deja que se una a la matriz de proteína de fusión GST. Esto permite que cualquier anticuerpo que reconozca el antígeno sea capturado en el soporte sólido. La elución de los anticuerpos de interés se consigue con mayor frecuencia utilizando un tampón de pH bajo como glicina pH 2,8. El eluido se recoge en un tris neutroo tampón fosfato, para neutralizar el tampón de elución de pH bajo y detener cualquier degradación de la actividad del anticuerpo. Este es un buen ejemplo, ya que la purificación por afinidad se usa para purificar la proteína de fusión inicial de GST, para eliminar los anticuerpos anti-GST indeseables del suero y para purificar el anticuerpo diana.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden seleccionar para unir proteínas con gran especificidad, donde la proteína se libera en condiciones bastante suaves. Esto puede resultar útil para futuras investigaciones. ^[15]

A menudo se emplea una estrategia simplificada para purificar anticuerpos generados contra antígenos peptídicos . Cuando los antígenos peptídicos se producen sintéticamente, se añade un residuo de cisteína terminal en el extremo N o C del péptido. Este residuo de cisteína contiene un grupo funcional sulfhidrilo que permite que el péptido se conjugue fácilmente con una proteína transportadora (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)). El mismo péptido que contiene cisteína también se inmoviliza sobre una resina de agarosa a través del residuo de cisteína y luego se usa para purificar el anticuerpo.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales se han purificado mediante cromatografía de afinidad basada en la proteína A o la proteína G específica de inmunoglobulina , derivada de bacterias. ^[dieciséis]

La cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales inmovilizados en columna monolítica se ha utilizado con éxito para capturar vesículas extracelulares (p. Ej., Exosomas y exómeros) del plasma sanguíneo humano dirigiéndose a las tetraspaninas y las integrinas que se encuentran en la superficie de los vehículos eléctricos. ^{[17] [18]}

La cromatografía de inmunoafinidad también es la base de las tiras de prueba inmunocromatográfica (ICT), que proporcionan un medio rápido de diagnóstico en la atención al paciente. Con las TIC, un técnico puede tomar una determinación junto a la cama de un paciente, sin necesidad de un laboratorio. ^{[19] La} detección de las TIC es muy específica del microbio que causa la infección. ^[20]

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados

La cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) se basa en el enlace covalente coordinado específico de los aminoácidos, en particular la histidina, con los metales. Esta técnica funciona al permitir que las proteínas con afinidad por los iones metálicos se retengan en una columna que contiene iones metálicos inmovilizados, como cobalto, níquel, cobre para la purificación de proteínas o péptidos que contienen histidina, hierro, zinc o galio para la purificación de proteínas o péptidos fosforilados. Muchas proteínas de origen natural no tienen afinidad por los iones metálicos, por lo que se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para introducir dicha etiqueta de proteína en el gen relevante. Los métodos utilizados para eluir la proteína de interés incluyen cambiar el pH o agregar una molécula competitiva, como imidazol.. ^{[21] [22]}

Una columna de cromatografía que contiene perlas de níquel-agarosa utilizadas para la purificación de proteínas con etiquetas de histidina.

Ver también: etiqueta de polihistidina

Proteínas recombinantes

Posiblemente, el uso más común de la cromatografía de afinidad es para la purificación de proteínas recombinantes. Las proteínas con una afinidad conocida se etiquetan con proteínas para ayudar a su purificación. La proteína puede haber sido modificada genéticamente para permitir que se seleccione para la unión por afinidad; esto se conoce como proteína de fusión. Las etiquetas incluyen hexahistidina ( His ), glutatión -S-transferasa (GST) y proteína de unión a maltosa (MBP). Las etiquetas de histidina tienen afinidad por el níquel , cobalto , zinc , cobre y hierro.iones que han sido inmovilizados formando enlaces covalentes coordinados con un quelante incorporado en la fase estacionaria. Para la elución , se usa una cantidad en exceso de un compuesto capaz de actuar como ligando de iones metálicos, tal como imidazol . GST tiene afinidad por el glutatión que está disponible comercialmente inmovilizado como glutatión agarosa. Durante la elución, se utiliza un exceso de glutatión para desplazar la proteína marcada.

Lectinas

La cromatografía de afinidad de lectinas es una forma de cromatografía de afinidad en la que se utilizan lectinas para separar componentes dentro de la muestra. Las lectinas, como la concanavalina A, son proteínas que pueden unirse a moléculas de carbohidratos de alfa-D-manosa y alfa-D-glucosa específicas. Algunas moléculas de carbohidratos comunes que se utilizan en la cromatografía de afinidad de lectina son Con A-Sepharose y WGA-agarosa. ^[23] Otro ejemplo de lectina es la aglutinina de germen de trigo que se une a DN-acetil-glucosamina. ^[24] La aplicación más común es separar glicoproteínas de proteínas no glicosiladas, o una glicoforma de otra glicoforma. ^[25]Aunque hay varias formas de realizar la cromatografía de afinidad de lectina, el objetivo es extraer un ligando de azúcar de la proteína deseada. ^[23]

Especialidad

Otro uso de la cromatografía de afinidad es la purificación de proteínas específicas utilizando una matriz de gel que es única para una proteína específica. Por ejemplo, la purificación de la β-galactosidasa de E. coli se realiza mediante cromatografía de afinidad utilizando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa como matriz de afinidad. La p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa se utiliza como matriz de afinidad porque contiene un grupo galactopiranosil, que sirve como un buen sustrato análogo para E. Coli-B-Galactosidasa. Esta propiedad permite que la enzima se una a la fase estacionaria de la matriz de afinidad y se eluye añadiendo concentraciones crecientes de sal a la columna. ^[26]

Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina de E. coli se puede purificar usando una matriz de DEAE-celulosa. La A. fosfatasa tiene una ligera carga negativa, lo que le permite unirse débilmente a los grupos amina cargados positivamente en la matriz. Luego, la enzima se puede eluir agregando tampón con concentraciones de sal más altas. ^[27]

Cromatografía de afinidad por boronato

La cromatografía de afinidad por boronato consiste en utilizar ácido borónico o boronatos para eluir y cuantificar cantidades de glicoproteínas . Las adaptaciones clínicas han aplicado este tipo de cromatografía para su uso en la determinación de la evaluación a largo plazo de pacientes diabéticos mediante el análisis de su hemoglobina glucosilada . ^[24]

Purificación de albúmina sérica

De los muchos usos de la cromatografía de afinidad, uno se ve en la purificación por afinidad de la contaminación de albúmina y macroglobulina. Este tipo de purificación es útil para eliminar el exceso de albúmina y la contaminación de α ₂ -macroglobulina, cuando se realiza espectrometría de masas. En la purificación por afinidad de la albúmina sérica, el material estacionario usado para recolectar o atraer proteínas séricas puede ser Cibacron Blue-Sepharose. Luego, las proteínas del suero se pueden eluir del adsorbente con un tampón que contiene tiocianato (SCN ^- ). ^[28]

Cromatografía de afinidad débil

La cromatografía de afinidad débil ^[29] (WAC) es una técnica de cromatografía de afinidad para el cribado de afinidad en el desarrollo de fármacos. ^{[30] [31]} WAC es una técnica de cromatografía líquida basada en afinidad que separa compuestos químicos en función de sus diferentes afinidades débiles a un objetivo inmovilizado. Cuanto mayor sea la afinidad que tenga un compuesto hacia el objetivo, más tiempo permanecerá en la unidad de separación, y esto se expresará como un tiempo de retención más prolongado. La medida de la afinidad y la clasificación de la afinidad se pueden lograr procesando los tiempos de retención obtenidos de los compuestos analizados.

La tecnología WAC está demostrada contra una serie de diferentes objetivos de proteínas : proteasas , quinasas , chaperonas y objetivos de interacción proteína-proteína (PPI). Se ha demostrado que WAC es más eficaz que los métodos establecidos para el cribado basado en fragmentos. ^[31]

Historia

La cromatografía de afinidad fue concebida y desarrollada por primera vez por Pedro Cuatrecasas y Meir Wilchek . ^{[32] [33]}

Referencias

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Enlaces externos

"Principio de cromatografía de afinidad, procedimiento y nota detallada anticipada - 2020".

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