Microscopía de reflexión de interferencias
La microscopía de reflexión de interferencias ( IRM ) es una técnica de microscopía óptica que utiliza luz polarizada para formar una imagen de un objeto en una superficie de vidrio. La intensidad de la señal es una medida de la proximidad del objeto a la superficie del vidrio. Esta técnica se puede utilizar para estudiar eventos en la membrana celular sin el uso de una etiqueta (fluorescente) en contraste con la microscopía TIRF .
El método se utilizó por primera vez para el estudio de películas delgadas de aceite. [1] [2] En 1964, Curtis introdujo la primera aplicación de la técnica en biología celular para estudiar fibroblastos embrionarios de corazón de pollo. [3] Usó IRM para observar los sitios de adhesión y las distancias de los fibroblastos, y señaló que el contacto con el vidrio se limitaba principalmente a la periferia celular y los pseudópodos . [3]
La técnica fue refinada y los aspectos cualitativos y cuantitativos de la técnica fueron descritos posteriormente por varios investigadores en los años 70 y 80: [4] Bereiter-Hahn y sus colegas correlacionaron la técnica con la microscopía electrónica , mostrando que diferentes líneas de células de mamíferos se adhieren a la sustrato de vidrio en sitios de adhesión focal específicos. [5]
Para formar una imagen de la celda adjunta, se pasa luz de una longitud de onda específica a través de un polarizador . Esta luz polarizada lineal es reflejada por un divisor de haz hacia el objetivo , que enfoca la luz sobre la muestra. La superficie del vidrio es reflectante hasta cierto punto y reflejará la luz polarizada. La luz que no es reflejada por el vidrio viajará al interior de la célula y será reflejada por la membrana celular. Pueden ocurrir tres situaciones. Primero, cuando la membrana está cerca del vidrio, la luz reflejada del vidrio cambia la mitad de una longitud de onda, de modo que la luz reflejada por la membrana tendrá un cambio de fase en comparación con la luz reflejada de las fases del vidrio.y por lo tanto se anulan ( interferencia ). Esta interferencia da como resultado un píxel oscuro en la imagen final (el caso de la izquierda en la figura). En segundo lugar, cuando la membrana no está unida al vidrio, el reflejo de la membrana tiene un cambio de fase más pequeño en comparación con la luz reflejada del vidrio y, por lo tanto, no se cancelarán entre sí, lo que dará como resultado un píxel brillante en la imagen ( el caso de la derecha en la figura). En tercer lugar, cuando no hay una muestra, solo se detecta la luz reflejada del vidrio y aparecerá como píxeles brillantes en la imagen final.
La luz reflejada viajará de regreso al divisor de haz y pasará a través de un segundo polarizador, que elimina la luz dispersa, antes de llegar al detector (generalmente una cámara CCD ) para formar la imagen final. Los polarizadores pueden aumentar la eficiencia al reducir la luz dispersa; sin embargo, en una configuración moderna con una cámara digital sensible, no son necesarios. [6]
La reflexión es causada por un cambio en el índice de refracción, por lo que en cada límite se reflejará una parte de la luz. La cantidad de reflexión viene dada por el coeficiente de reflexión , de acuerdo con la siguiente regla: [4]
