SDS-PAGE ( electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio ), es un sistema electroforético discontinuo desarrollado por Ulrich K. Laemmli que se utiliza comúnmente como método para separar proteínas con masas moleculares entre 5 y 250 kDa . [1] [2] El uso combinado de dodecilsulfato de sodio (SDS, también conocido como laurilsulfato de sodio) y gel de poliacrilamida permite eliminar la influencia de la estructura y la carga, y las proteínas se separan únicamente sobre la base de diferencias en su peso molecular. .
Propiedades
SDS-PAGE es un método de electroforesis que permite la separación de proteínas por masa. El medio (también denominado "matriz") es un gel discontinuo a base de poliacrilamida. El gel de poliacrilamida se intercala típicamente entre dos placas de vidrio en una placa de gel . Aunque los geles de tubo (en cilindros de vidrio) se usaron históricamente, rápidamente se volvieron obsoletos con la invención de los geles en placa más convenientes. [3] Además, se utiliza SDS ( dodecil sulfato de sodio ). Aproximadamente 1,4 gramos de SDS se unen a un gramo de proteína, [4] [5] [6] correspondientes a una molécula de SDS por dos aminoácidos . El SDS actúa como tensioactivo , enmascarando la carga intrínseca de las proteínas y confiriéndoles proporciones de carga a masa muy similares. Las cargas intrínsecas de las proteínas son insignificantes en comparación con la carga de SDS, y las cargas positivas también se reducen en gran medida en el rango de pH básico de un gel de separación. Tras la aplicación de un campo eléctrico constante, la proteína migra hacia el ánodo, cada uno con una velocidad diferente, dependiendo de su masa. Este sencillo procedimiento permite una separación precisa de proteínas por masa.
El SDS tiende a formar micelas esféricas en soluciones acuosas por encima de una cierta concentración llamada concentración micelar crítica (CMC). Por encima de la concentración micelar crítica de 7 a 10 milimolar en soluciones, el SDS ocurre simultáneamente como moléculas individuales ( monómero ) y como micelas, por debajo de la CMC SDS ocurre solo como monómeros en soluciones acuosas. En la concentración micelar crítica, una micela consta de aproximadamente 62 moléculas de SDS. [7] Sin embargo, solo los monómeros de SDS se unen a proteínas a través de interacciones hidrofóbicas, mientras que las micelas de SDS son aniónicas en el exterior y no adsorben ninguna proteína. [4] El SDS es de naturaleza anfipática, lo que le permite desplegar secciones polares y no polares de la estructura de la proteína. [8] En concentraciones de SDS por encima de 0,1 milimolar, comienza el despliegue de las proteínas, [4] y por encima de 1 mM, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan. [4] Debido al fuerte efecto desnaturalizante de SDS y la posterior disociación de complejos de proteínas, las estructuras cuaternarias generalmente no se pueden determinar con SDS. Las excepciones son las proteínas que se estabilizan mediante reticulación covalente, por ejemplo, enlaces -SS- y los complejos proteicos resistentes a SDS, que son estables incluso en presencia de SDS (este último, sin embargo, solo a temperatura ambiente). Para desnaturalizar los complejos resistentes a SDS se requiere una alta energía de activación, que se consigue mediante calentamiento. La resistencia al SDS se basa en una metaestabilidad del pliegue proteico. Aunque la proteína nativa, completamente plegada, resistente a SDS no tiene suficiente estabilidad en presencia de SDS, el equilibrio químico de desnaturalización a temperatura ambiente ocurre lentamente. Los complejos de proteínas estables se caracterizan no solo por la resistencia al SDS sino también por la estabilidad frente a las proteasas y una vida media biológica aumentada . [9]
Alternativamente, la electroforesis en gel de poliacrilamida también se puede realizar con los tensioactivos catiónicos CTAB en un CTAB-PAGE, [10] [11] [12] o 16-BAC en un BAC-PAGE. [13]
Procedimiento
El método SDS-PAGE se compone de preparación de gel, preparación de muestras, electroforesis, tinción de proteínas o transferencia Western y análisis del patrón de bandas generado.
Producción de gel
Cuando se utilizan diferentes tampones en el gel (electroforesis en gel discontinua), los geles se preparan hasta un día antes de la electroforesis, de modo que la difusión no dé lugar a una mezcla de los tampones. El gel se produce mediante polimerización radical en un molde que consta de dos placas de vidrio selladas con espaciadores entre las placas de vidrio. En una configuración típica de mini-gel, los espaciadores tienen un grosor de 0,75 mm o 1,5 mm, lo que determina la capacidad de carga del gel. Para verter la solución de gel, las placas generalmente se sujetan con abrazaderas en un soporte que sella temporalmente la parte inferior abierta de las placas de vidrio con los dos espaciadores. Para la solución de gel, se mezcla acrilamida como formador de gel (generalmente 4% V / V en el gel de apilamiento y 10-12% en el gel de separación), metilenbisacrilamida como reticulante, tampón de gel de apilamiento o separación, agua y SDS . Añadiendo el catalizador TEMED y el iniciador de radicales persulfato de amonio (APS) se inicia la polimerización. Luego, la solución se vierte entre las placas de vidrio sin crear burbujas. Dependiendo de la cantidad de catalizador y radical iniciador y dependiendo de la temperatura, la polimerización dura entre un cuarto de hora y varias horas. El gel inferior (gel de separación) se vierte primero y se cubre con unas gotas de un alcohol apenas soluble en agua (generalmente butanol saturado con tampón o isopropanol), que elimina las burbujas del menisco y protege la solución de gel del oxígeno eliminador de radicales . Después de la polimerización del gel separador, el alcohol se descarta y el alcohol residual se elimina con papel de filtro . Después de la adición de APS y TEMED a la solución de gel de apilamiento, se vierte sobre el gel de separación sólido. Posteriormente, se inserta un peine de muestras adecuado entre las placas de vidrio sin crear burbujas. El peine de muestra se saca con cuidado después de la polimerización, dejando bolsillos para la aplicación de la muestra. Para el uso posterior de proteínas para la secuenciación de proteínas , los geles a menudo se preparan el día antes de la electroforesis para reducir las reacciones de acrilamida sin polimerizar con cisteínas en proteínas.
Mediante el uso de un mezclador de gradiente , se pueden moldear geles de gradiente con un gradiente de acrilamida (generalmente de 4 a 12%), que tienen un rango de separación más grande de las masas moleculares. [14] Los sistemas de gel comerciales (los denominados geles prefabricados ) suelen utilizar la sustancia tampón Bis-tris metano con un valor de pH entre 6,4 y 7,2 tanto en el gel de apilamiento como en el gel de separación. [15] [16] Estos geles se entregan moldeados y listos para usar. Dado que usan solo un tampón ( electroforesis en gel continua ) y tienen un pH casi neutro, se pueden almacenar durante varias semanas. El pH más neutro ralentiza la hidrólisis y, por tanto, la descomposición de la poliacrilamida. Además, hay menos cisteínas modificadas con acrilamida en las proteínas. [15] Debido al pH constante en la recolección y separación del gel, no hay efecto de apilamiento. Las proteínas de los geles BisTris no se pueden teñir con complejos de rutenio. [17] Este sistema de gel tiene un rango de separación comparativamente grande, que puede variarse usando MES o MOPS en el búfer de ejecución. [15]
preparación de la muestra
Durante la preparación de la muestra, el tampón de la muestra, y por lo tanto el SDS, se agrega en exceso a las proteínas y luego la muestra se calienta a 95 ° C durante cinco minutos, o alternativamente a 70 ° C durante diez minutos. El calentamiento altera las estructuras secundarias y terciarias de la proteína al romper los enlaces de hidrógeno y estirar las moléculas. Opcionalmente, los puentes disulfuro se pueden escindir por reducción. Para ello, se añaden tioles reductores como β-mercaptoetanol (β-ME, 5% en volumen), ditiotreitol (DTT, 10 milimolar) o ditioeritritol (DTE, 10 milimolar) al tampón de muestra. Después de enfriar a temperatura ambiente, cada muestra se pipetea en su propio pozo en el gel, que previamente se sumergió en tampón de electroforesis en el aparato de electroforesis.
Además de las muestras, normalmente se carga en el gel un marcador de tamaño de peso molecular . Este se compone de proteínas de tamaños conocidos y, por tanto, permite la estimación (con un error de ± 10%) de los tamaños de las proteínas en las muestras reales, que migran en paralelo en diferentes pistas del gel. [18] El marcador de tamaño a menudo se pipetea en la primera o última bolsa de un gel.
Electroforesis
Para la separación, las muestras desnaturalizadas se cargan en un gel de poliacrilamida, que se coloca en un tampón de electroforesis con electrolitos adecuados. A partir de entonces, se aplica un voltaje (generalmente alrededor de 100 V, 10-20 V por cm de longitud de gel), lo que provoca una migración de moléculas cargadas negativamente a través del gel en la dirección del ánodo cargado positivamente . El gel actúa como un colador. Las proteínas pequeñas migran con relativa facilidad a través de la malla del gel, mientras que es más probable que las proteínas más grandes se retengan y, por lo tanto, migren más lentamente a través del gel, lo que permite que las proteínas se separen por tamaño molecular. La electroforesis dura entre media hora y varias horas, dependiendo del voltaje y la duración del gel utilizado.
Las proteínas de migración más rápida (con un peso molecular de menos de 5 kDa) forman el frente del tampón junto con los componentes aniónicos del tampón de electroforesis, que también migran a través del gel. El área del frente del tampón se hace visible agregando el colorante aniónico azul de bromofenol comparativamente pequeño al tampón de muestra. Debido al tamaño relativamente pequeño de la molécula del azul de bromofenol, migra más rápido que las proteínas. Mediante el control óptico de la banda coloreada migrante, la electroforesis puede detenerse antes de que el tinte y también las muestras hayan migrado completamente a través del gel y lo abandonen.
El método más utilizado es el SDS-PAGE discontinuo. En este método, las proteínas migran primero a un gel colector con pH neutro, en el que se concentran y luego migran a un gel separador con pH básico, en el que tiene lugar la propia separación. Los geles de apilamiento y separación se diferencian por diferentes tamaños de poros (4-6% T y 10-20% T), fuerza iónica y valores de pH (pH 6,8 o pH 8,8). El electrolito utilizado con mayor frecuencia es una que contienen SDS- Tris - glicina - cloruro de tampón de sistema. A pH neutro, la glicina forma predominantemente la forma zwiteriónica , a pH alto las glicinas pierden cargas positivas y se vuelven predominantemente aniónicas. En el gel de recolección, los iones cloruro más pequeños y cargados negativamente migran frente a las proteínas (como iones principales) y los iones glicinato ligeramente más grandes, cargados negativamente y parcialmente positivamente migran detrás de las proteínas (como iones iniciales de seguimiento), mientras que en el gel separador básico ambos iones migran delante de las proteínas. El gradiente de pH entre los tampones de gel de apilamiento y de separación conduce a un efecto de apilamiento en el borde del gel de apilamiento al gel de separación, ya que el glicinato pierde parcialmente sus cargas positivas lentas a medida que aumenta el pH y luego, como el ión de cola anterior, alcanza las proteínas y se convierte en un ión líder, lo que hace que las bandas de las diferentes proteínas (visibles después de una tinción) se vuelvan más estrechas y nítidas: el efecto de apilamiento. Para la separación de proteínas y péptidos más pequeños, se utiliza el sistema tampón TRIS- Tricina de Schägger y von Jagow debido a la mayor dispersión de las proteínas en el rango de 0,5 a 50 kDa. [19]
Tinción de gel
Al final de la separación electroforética, todas las proteínas se clasifican por tamaño y luego se pueden analizar con otros métodos, por ejemplo, tinción de proteínas como la tinción de Coomassie (la más común y fácil de usar), [20] [21] tinción de plata (mayor sensibilidad ), [22] [23] [24] [25] [26] [27] tiñe todas las tinciones, tinción con negro amido 10B , [21] tinción verde rápida con FCF , [21] tinciones fluorescentes como la tinción con epicocconona [28] y Tinción naranja SYPRO, [29] y detección inmunológica como Western Blot . [30] [31] Los colorantes fluorescentes tienen una linealidad comparativamente más alta entre la cantidad de proteína y la intensidad del color de aproximadamente tres órdenes de magnitud por encima del límite de detección , es decir, la cantidad de proteína se puede estimar por la intensidad del color. Cuando se usa el tinte de proteína fluorescente tricloroetanol , se omite una tinción de proteína posterior si se agregó a la solución de gel y el gel se irradió con luz UV después de la electroforesis. [32] [33]
En la tinción de Coomassie , el gel se fija en una solución de ácido acético glacial al 10% de etanol al 50% durante 1 hora. Luego, la solución se cambia por una nueva y, después de 1 a 12 horas, el gel se cambia a una solución de tinción (50% de metanol, 10% de ácido acético glacial, 0,1% de azul brillante de Coomassie) seguido de decoloración cambiando varias veces una solución decolorante de 40% metanol, ácido acético glacial al 10%.
Análisis
La tinción de proteínas en el gel crea un patrón de bandas documentable de las diversas proteínas. Las glicoproteínas tienen niveles diferenciales de glicosilaciones y adsorben SDS de manera más desigual en las glicosilaciones, lo que da como resultado bandas más anchas y borrosas. [34] Las proteínas de membrana , debido a su dominio transmembrana , a menudo se componen de los aminoácidos más hidrófobos, tienen menor solubilidad en soluciones acuosas, tienden a unir lípidos y tienden a precipitar en soluciones acuosas debido a los efectos hidrófobos cuando hay cantidades suficientes de detergente. no están presentes. Esta precipitación se manifiesta para las proteínas de membrana en una SDS-PAGE en "cola" por encima de la banda de la proteína transmembrana. En este caso, se pueden usar más SDS (usando más o más tampón de muestra concentrado) y se puede reducir la cantidad de proteína en la aplicación de muestra. Una sobrecarga del gel con una proteína soluble crea una banda semicircular de esta proteína (por ejemplo, en el carril marcador de la imagen a 66 kDa), lo que permite cubrir otras proteínas con pesos moleculares similares. Un contraste bajo (como en el carril marcador de la imagen) entre las bandas dentro de un carril indica la presencia de muchas proteínas (baja pureza) o, si se usan proteínas purificadas y el contraste bajo ocurre solo por debajo de una banda, indica una degradación proteolítica de la proteína, que primero causa bandas de degradación, y después de una degradación adicional produce un color homogéneo ("mancha") debajo de una banda. [35] La documentación del patrón de bandas generalmente se realiza mediante fotografía o escaneo. Para una posterior recuperación de las moléculas en bandas individuales, se puede realizar una extracción en gel .
Archivar
Después de la tinción de proteínas y la documentación del patrón de bandas, el gel de poliacrilamida se puede secar para almacenarlo. Las proteínas se pueden extraer de él en una fecha posterior. El gel se coloca en un marco de secado (con o sin el uso de calor) o en un secador de vacío. El marco de secado consta de dos partes, una de las cuales sirve como base para una película de celofán húmeda a la que se añaden el gel y una solución de glicerol al uno por ciento . Luego se aplica una segunda película de celofán húmedo sin burbujas, se coloca la segunda parte del marco en la parte superior y se sella el marco con clips. La eliminación de las burbujas de aire evita una fragmentación del gel durante el secado. El agua se evapora a través de la película de celofán. En contraste con el marco de secado, un secador de vacío genera un vacío y calienta el gel a aproximadamente 50 ° C.
Determinación de masa molecular
Para una determinación más precisa del peso molecular, las distancias de migración relativas de las bandas de proteínas individuales se miden en el gel de separación. [36] [37] Las mediciones generalmente se realizan por triplicado para una mayor precisión. La movilidad relativa (denominada valor Rf o valor Rm) es el cociente de la distancia de la banda de la proteína y la distancia del frente del búfer. Las distancias de las bandas y el frente del tampón se miden desde el comienzo del gel de separación. La distancia del frente del tampón corresponde aproximadamente a la distancia del azul de bromofenol contenido en el tampón de muestra. Las distancias relativas de las proteínas del marcador de tamaño se representan semilogarítmicamente frente a sus pesos moleculares conocidos. En comparación con la parte lineal del gráfico generado o mediante un análisis de regresión, el peso molecular de una proteína desconocida se puede determinar por su movilidad relativa. Las bandas de proteínas con glicosilaciones pueden aparecer borrosas. [34] Las proteínas con muchos aminoácidos básicos (por ejemplo, histonas ) [38] pueden llevar a una sobreestimación del peso molecular o incluso no migrar en absoluto al gel, porque se mueven más lentamente en la electroforesis debido a las cargas positivas o incluso a la dirección opuesta. En consecuencia, muchos aminoácidos ácidos pueden conducir a una migración acelerada de una proteína y a una subestimación de su masa molecular. [39]
Aplicaciones
El SDS-PAGE en combinación con una tinción de proteínas se usa ampliamente en bioquímica para la separación rápida y exacta y el análisis posterior de proteínas. Tiene costos comparativamente bajos de instrumentos y reactivos y es un método fácil de usar. Debido a su baja escalabilidad , se utiliza principalmente con fines analíticos y menos con fines preparativos, especialmente cuando se van a aislar grandes cantidades de una proteína.
Además, SDS-PAGE se usa en combinación con el western blot para la determinación de la presencia de una proteína específica en una mezcla de proteínas, o para el análisis de modificaciones postraduccionales . Las modificaciones postraduccionales de proteínas pueden conducir a una movilidad relativa diferente (es decir, un cambio de banda ) o un cambio en la unión de un anticuerpo de detección utilizado en la transferencia de Western (es decir, una banda desaparece o aparece).
En espectrometría de masas de proteínas, SDS-PAGE es un método ampliamente utilizado para la preparación de muestras antes de la espectrometría, principalmente mediante digestión en gel . En lo que respecta a la determinación de la masa molecular de una proteína, la SDS-PAGE es un poco más exacta que una ultracentrifugación analítica , pero menos exacta que una espectrometría de masas o, ignorando las modificaciones postraduccionales, un cálculo de la masa molecular de la proteína a partir del ADN. secuencia .
En el diagnóstico médico, SDS-PAGE se utiliza como parte de la prueba del VIH y para evaluar la proteinuria . En la prueba del VIH, las proteínas del VIH se separan mediante SDS-PAGE y posteriormente se detectan mediante Western Blot con anticuerpos específicos del VIH del paciente, si están presentes en su suero sanguíneo . SDS-PAGE para proteinuria evalúa los niveles de varias proteínas séricas en la orina, por ejemplo , albúmina , alfa-2-macroglobulina e IgG .
Variantes
SDS-PAGE es el método más utilizado para la separación electroforética de proteínas en gel. La electroforesis en gel bidimensional combina secuencialmente el enfoque isoeléctrico o BAC-PAGE con una SDS-PAGE. La PAGE nativa se usa si se debe mantener el plegamiento de la proteína nativa. Para la separación de proteínas de membrana, se pueden utilizar BAC-PAGE o CTAB-PAGE como alternativa a SDS-PAGE. Para la separación electroforética de complejos de proteínas más grandes, se puede usar electroforesis en gel de agarosa , por ejemplo, SDD-AGE . Algunas enzimas pueden detectarse a través de su actividad enzimática mediante zimografía .
Alternativas
Si bien es uno de los métodos de análisis y separación de proteínas más precisos y económicos, el SDS-PAGE desnaturaliza las proteínas. Cuando son necesarias condiciones no desnaturalizantes, las proteínas se separan mediante una PAGE nativa o diferentes métodos cromatográficos con cuantificación fotométrica posterior , por ejemplo, cromatografía de afinidad (o incluso purificación de afinidad en tándem ), cromatografía de exclusión por tamaño , cromatografía de intercambio iónico . [40] Las proteínas también se pueden separar por tamaño en una filtración de flujo tangencial [41] o una ultrafiltración . [42] Las proteínas individuales se pueden aislar de una mezcla mediante cromatografía de afinidad o mediante un ensayo de reducción . Algunos métodos de separación históricamente tempranos y rentables, pero crudos, generalmente se basan en una serie de extracciones y precipitaciones usando moléculas kosmotrópicas , por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio y la precipitación con polietilenglicol .
Historia
En 1948, Arne Tiselius recibió el Premio Nobel de Química por el descubrimiento del principio de electroforesis como la migración de átomos o moléculas cargados y disueltos en un campo eléctrico. [43] El uso de una matriz sólida (inicialmente discos de papel) en una electroforesis de zona mejoró la separación. La electroforesis discontinua de 1964 de L. Ornstein y BJ Davis permitió mejorar la separación por efecto de apilamiento. [44] El uso de hidrogeles de poliacrilamida reticulados, en contraste con los discos de papel o geles de almidón utilizados anteriormente, proporcionó una mayor estabilidad del gel y ninguna descomposición microbiana. El efecto desnaturalizante de SDS en geles de poliacrilamida continuos y la consecuente mejora en la resolución fue descrito por primera vez en 1965 por David F. Summers en el grupo de trabajo de James E. Darnell para separar proteínas de poliovirus. [45] La variante actual de SDS-PAGE fue descrita en 1970 por Ulrich K. Laemmli y se utilizó inicialmente para caracterizar las proteínas en la cabeza del bacteriófago T4 . [1] Este artículo de Laemmli es ampliamente citado por la invención del SDS-PAGE moderno, pero la técnica fue realmente inventada por Jake Maizel, quien estaba haciendo un año sabático en el laboratorio de MRC cuando Laemmli se unió al laboratorio como becario postdoctoral. Maizel compartió su tecnología anterior con Laemmli y juntos hicieron más mejoras. Laemmli y Maizel habían planeado hacer un seguimiento con un artículo de Métodos, pero esto nunca se materializó. Maizel relata la historia del desarrollo de SDS-PAGE en un breve comentario. [46]
Referencias
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enlaces externos
- OpenWetWare: protocolo para BisTris SDS-PAGE