En bioquímica , la gráfica Lineweaver-Burk (o gráfica recíproca doble ) es una representación gráfica de la ecuación de la cinética enzimática de Lineweaver-Burk , descrita por Hans Lineweaver y Dean Burk en 1934. [1] La gráfica Lineweaver-Burk para enzimas inhibidas puede compararse con ningún inhibidor para determinar cómo el inhibidor compite con la enzima. [2]
El gráfico de Lineweaver-Burk es correcto cuando la cinética de la enzima obedece a la cinética ideal de segundo orden, sin embargo, se necesita una regresión no lineal para los sistemas que no se comportan de manera ideal. El gráfico recíproco doble distorsiona la estructura del error de los datos y, por lo tanto, no es la herramienta más precisa para la determinación de los parámetros cinéticos de la enzima. [3] La regresión no lineal o formas lineales alternativas de la ecuación de Michaelis-Menten , como la gráfica de Hanes-Woolf o la gráfica de Eadie-Hofstee, se utilizan generalmente para el cálculo de parámetros. [4]
Definiciones para interpretar la gráfica
[S]: concentración de sustrato. El eje independiente de la gráfica de Lineweaver-Burk es el recíproco de la concentración de sustrato. [2]
V 0 o V: velocidad inicial de una reacción inhibida por enzima. El eje dependiente del gráfico Lineweaver-Burk es el recíproco de la velocidad. [5]
V max : velocidad máxima de la reacción. La intersección con el eje y del gráfico Lineweaver-Burk es el recíproco de la velocidad máxima. [2]
K M : constante de Michaelis-Menten o afinidad enzimática. Cuanto menor sea el K M, mayor será la afinidad. Gráficamente, la intersección con el eje x de la línea es -1 / K M. [5]
K cat : número de rotación o reacciones por unidad de tiempo. Cuanto menor sea el K cat, más lenta será la reacción. K cat = V max / [Enzima]. Gráficamente, esto se puede evaluar mirando V máx. [2]
Eficiencia catalítica = K cat / K M . Un catalizador rápido y una alta afinidad dan como resultado la mejor eficiencia catalítica. [5]
= dónde es la concentración de inhibición y es la constante del inhibidor. Alfa determina el grado en que la unión de un inhibidor afecta la cinética enzimática de un sustrato, siempre tiene un valor positivo. [5]
Derivación
El gráfico proporciona un método gráfico útil para el análisis de la ecuación de Michaelis-Menten , ya que es difícil determinar con precisión el V máx de una reacción catalizada por enzimas:
Tomando lo recíproco da:
El gráfico Lineweaver-Burk coloca 1 / [S] en el eje xy 1 / V en el eje y . [6]
Aplicaciones
Cuando se utiliza para determinar el tipo de inhibición enzimática, la gráfica de Lineweaver-Burk puede distinguir inhibidores competitivos , puros no competitivos y no competitivos . Los diversos modos de inhibición se pueden comparar con la reacción no inhibida.
Inhibición competitiva
V max no se ve afectado por inhibidores competitivos. Por lo tanto, los inhibidores competitivos tienen la misma intersección con el eje y que las enzimas no inhibidas (dado que V max no se ve afectado por los inhibidores competitivos, la inversa de V max tampoco cambia).
La inhibición competitiva aumenta la K M o reduce la afinidad del sustrato. El K M inhibido esK M . [5] Gráficamente, esto puede verse como la enzima inhibida que tiene una intersección con el eje x más grande. [2] Las pendientes de las enzimas inhibidas competitivamente y las enzimas no inhibidas son diferentes. La inhibición competitiva se muestra en la imagen del extremo izquierdo.
Inhibición pura no competitiva
Con inhibición no competitiva pura, V max se reduce con inhibición. V max inhibido esV máx . [5] Esto se puede ver en el gráfico de Lineweaver-Burk como una intersección y aumentada con inhibición, ya que se traza el recíproco. [7]
La inhibición pura no competitiva no afecta la afinidad del sustrato, por lo tanto, K M permanece sin cambios. Gráficamente, esto se puede ver en que las enzimas con inhibición pura no competitiva se cruzan con enzimas no inhibidas en el eje x. [2] Las pendientes de las enzimas inhibidas no competitivas puras y las enzimas no inhibidas son diferentes. [7] La inhibición pura no competitiva se muestra en la imagen del extremo derecho.
Inhibición mixta
La inhibición pura no competitiva es rara, lo que significa que es más probable que se produzca una inhibición mixta. En el caso de inhibición mixta, V max y K M se efectúan ambos a una velocidad no proporcional. En la mayoría de los casos, la V max disminuye, mientras que la K M aumenta, lo que significa que la afinidad generalmente disminuye con la inhibición mixta. Las líneas de inhibición mixta y sin inhibición se cruzan en algún lugar entre el eje xy el eje y, pero nunca en un eje con inhibición mixta. [5]
Inhibición no competitiva
V max disminuye con inhibición no competitiva. V max inhibido esV máx . [5] Esto se puede ver en el gráfico de Lineweaver-Burk como una intersección y aumentada con inhibición, ya que se traza el recíproco. [7] Esta relación se observa tanto en la inhibición no competitiva como en la inhibición competitiva pura. [5]
Sustrato de afinidad aumenta con la inhibición no competitiva, o baja K M . El K M inhibido es K M /. Gráficamente, esto significa que las enzimas con inhibición no competitiva tendrán una intersección x más pequeña que las enzimas no inhibidas. [5] A pesar de que la intersección con el eje x y la intersección con el eje y de la inhibición no competitiva cambian, la pendiente permanece constante. La inhibición no competitiva gráficamente puede identificarse porque la línea de enzima inhibida es paralela a la enzima no inhibida. La inhibición no competitiva se muestra en la imagen del medio.
Problemas con Lineweaver-Burk
Si bien Lineweaver-Burk es útil para determinar variables importantes en la cinética enzimática, es propenso a errores. El eje y del gráfico toma el recíproco de la velocidad de reacción, lo que significa que los pequeños errores en la medición son más notables. [8] Además, porque la mayoría de los puntos de la gráfica se encuentran muy a la derecha del eje y . valores grandes de [S] (y por lo tanto valores pequeños de 1 / [S] en el gráfico) a menudo no son posibles debido a la solubilidad limitada. [8]
Ver también
Referencias
- ↑ Lineweaver, Hans; Burk, Dean (marzo de 1934). "La determinación de las constantes de disociación enzimática" . Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 56 (3): 658–666. doi : 10.1021 / ja01318a036 . ISSN 0002-7863 .
- ^ a b c d e f Ahern, Rajagopal (2013). "Bioquímica Gratis y Fácil" . Educación en Bioquímica y Biología Molecular . 45 (1): 90-110. doi : 10.1002 / bmb.20979 . ISSN 1470-8175 . PMID 27228905 . S2CID 34758190 .
- ^ Srinivasan, Bharath (18 de marzo de 2021). "Tratamiento explícito de cinética atípica y no Michaelis-Menten en el descubrimiento temprano de fármacos **". ChemMedChem . 16 (6): 899–918. doi : 10.1002 / cmdc.202000791 . PMID 33231926 . S2CID 227157473 .
- ^ Greco, WR; Hakala, MT (10 de diciembre de 1979). "Evaluación de métodos para estimar la constante de disociación de inhibidores de enzimas de unión estrecha" . La revista de química biológica . 254 (23): 12104–12109. doi : 10.1016 / S0021-9258 (19) 86435-9 . ISSN 0021-9258 . PMID 500698 .
- ^ a b c d e f g h yo j Miesfeld, Roger L. (2017). Bioquímica . Megan M. McEvoy (1 ed.). Nueva York, NY: WW Norton & Company. págs. 340–370. ISBN 978-0-393-61402-2. OCLC 952277065 .
- ^ Christensen, Siegfried B .; DeWolf, Walter E .; Ryan, M. Dominic; Torphy, Theodore J. (1 de enero de 1996), Schudt, Christian; Dent, Gordon; Rabe, Klaus F. (eds.), "13 - Aspectos moleculares de la interacción del inhibidor con PDE4" , Inhibidores de fosfodiesterasa , Manual de inmunofarmacología, San Diego: Academic Press, págs. 185-207, doi : 10.1016 / b978-012210720-7 / 50015-0 , ISBN 978-0-12-210720-7, consultado 2020-12-15
- ^ a b c Ahern, Rajagopal, Tan (2018). "Bioquímica gratis para todos" . Educación en Bioquímica y Biología Molecular . 45 (1): 356–400. doi : 10.1002 / bmb.20979 . ISSN 1470-8175 . PMID 27228905 . S2CID 34758190 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ a b Dowd, John E .; Riggs, Douglas S. (febrero de 1965). "Una comparación de estimaciones de constantes cinéticas de Michaelis-Menten de diversas transformaciones lineales" . Revista de Química Biológica . 240 (2): 863–869. doi : 10.1016 / s0021-9258 (17) 45254-9 . ISSN 0021-9258 .
enlaces externos
- Guía de los NIH , desarrollo y análisis de ensayos enzimáticos