El experimento de Luria-Delbrück (1943) (también llamado Prueba de fluctuación ) demuestra que en las bacterias , las mutaciones genéticas surgen en ausencia de selección , en lugar de ser una respuesta a la selección. Por lo tanto, la teoría de la selección natural de Darwin que actúa sobre mutaciones aleatorias se aplica tanto a las bacterias como a los organismos más complejos. Max Delbrück y Salvador Luria ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1969 en parte por este trabajo.
Historia
En la década de 1940, las ideas de herencia y mutación estaban generalmente aceptadas, aunque aún no se había establecido el papel del ADN como material hereditario. Se pensaba que las bacterias eran de alguna manera diferentes y podrían desarrollar mutaciones genéticas hereditarias dependiendo de las circunstancias en las que se encontraran: en resumen, ¿la mutación en las bacterias era preadaptativa (preexistente) o posadaptativa (adaptación dirigida)? Luria en particular estaba obsesionada con esta idea y estaba decidida a probarla. Concibió el experimento en un baile de la facultad de la Universidad de Indiana mientras miraba una máquina tragamonedas . [1]
En su experimento, Luria y Delbrück inocularon una pequeña cantidad de bacterias ( Escherichia coli ) en tubos de cultivo separados . Después de un período de crecimiento, colocaron en placas volúmenes iguales de estos cultivos separados en agar que contenía el fago T1 (virus). Si la resistencia al virus en las bacterias fue causada por una activación inducida en las bacterias, es decir, si la resistencia no se debió a componentes genéticos hereditarios, entonces cada placa debería contener aproximadamente el mismo número de colonias resistentes. Suponiendo una tasa constante de mutación, Luria planteó la hipótesis de que si las mutaciones ocurrían después y en respuesta a la exposición al agente selectivo, el número de supervivientes se distribuiría de acuerdo con una distribución de Poisson con la media igual a la varianza . Esto no fue lo que encontraron Delbrück y Luria: en cambio, el número de colonias resistentes en cada placa varió drásticamente: la varianza fue considerablemente mayor que la media.
Luria y Delbrück propusieron que estos resultados podrían explicarse por la ocurrencia de una tasa constante de mutaciones aleatorias en cada generación de bacterias que crecen en los tubos de cultivo iniciales. Basado en estos supuestos, Delbrück derivó una distribución de probabilidad (ahora llamada distribución Luria-Delbrück [2] [3] ) que da una relación entre momentos consistente con los valores obtenidos experimentalmente. La distribución que se sigue de la hipótesis de adaptación dirigida (la distribución de Poisson) predijo momentos inconsistentes con los datos. Por tanto, la conclusión fue que las mutaciones en bacterias, como en otros organismos, son más aleatorias que dirigidas. [4]
Los resultados de Luria y Delbrück fueron confirmados de una manera más gráfica, pero menos cuantitativa, por Newcombe. Newcombe incubó las bacterias en una placa de Petri durante unas horas y luego las reprodujo en dos placas de Petri nuevas tratadas con fagos. La primera placa se dejó sin esparcir y la segunda placa se volvió a esparcir, es decir, las células bacterianas se movieron permitiendo que las células individuales de alguna colonia formaran sus propias colonias nuevas. Si las colonias contenían células bacterianas resistentes antes de entrar en contacto con el virus del fago, cabría esperar que algunas de estas células formaran nuevas colonias resistentes en la placa que se ha vuelto a difundir y, por tanto, encontrarán allí un mayor número de bacterias supervivientes. Cuando se incubaron ambas placas para el crecimiento, en realidad hubo hasta 50 veces más colonias bacterianas en la placa que se volvió a extender. Esto mostró que las mutaciones bacterianas de la resistencia al virus se habían producido de forma aleatoria durante la primera incubación. Una vez más, las mutaciones ocurrieron antes de que se aplicara la selección. [5]
Más recientemente, los resultados de Luria y Delbrück fueron cuestionados por Cairns y otros, que estudiaron mutaciones en el metabolismo del azúcar como una forma de estrés ambiental. [6] Algunos científicos sugieren que este resultado puede haber sido causado por la selección para la amplificación de genes y / o una tasa de mutación más alta en las células que no pueden dividirse. [7] Otros han defendido la investigación y proponen mecanismos que explican los fenómenos observados consistentes con la mutagénesis adaptativa . [8]
Esta distribución parece haber sido determinada por primera vez por Haldane . [9] En 1991, en el University College de Londres, se descubrió un manuscrito inédito que describe esta distribución. La derivación es diferente pero los resultados son difíciles de calcular sin el uso de una computadora.
Descripción de la prueba
Se utiliza un pequeño número de células para inocular cultivos paralelos en un medio no selectivo. [10] Los cultivos se hacen crecer hasta la saturación para obtener densidades celulares iguales. Las células se cultivan en placas en medios selectivos para obtener el número de mutantes ( r ). Las diluciones se siembran en medio rico para calcular el número total de células viables ( N t ). El número de mutantes que aparecen en el cultivo saturado es una medida tanto de la tasa de mutación como de cuándo surgen los mutantes durante el crecimiento del cultivo: los mutantes que aparecen temprano en el crecimiento del cultivo propagarán muchos más mutantes que los que surgen más tarde durante crecimiento. Estos factores hacen que la frecuencia ( r / N t ) varíe mucho, incluso si el número de eventos mutacionales ( m ) es el mismo. La frecuencia no es una medida de mutación suficientemente precisa y siempre debe calcularse la tasa de mutación ( m / N t ).
La estimación de la tasa de mutación (μ) es compleja. Luria y Delbruck estimaron este parámetro a partir de la media de la distribución, pero posteriormente se demostró que este estimador estaba sesgado.
El método Lea-Coulson de la mediana se introdujo en 1949. [11] Este método se basa en la ecuación
- Dónde:
- r = número medio de colonias en una placa que contiene el indicador (p. ej., rifampicina, clorato de sodio, estreptomicina)
- m = una variable que será variada, corresponde a las mutaciones / cultura
- El valor de la variable m se ajusta hasta que el valor total de la ecuación se acerca a 0. Luego, la tasa de mutación (probabilidad de una mutación / célula / división o generación) se puede calcular como una de tres fórmulas:
- (1)
- (2)
- (3)
- donde N t es la mediana del número de células viables en una placa no indicadora (a menudo agar LB sin aditivo)
- La elección de qué fórmula usar depende de en qué etapa de la división celular se espera que ocurran las mutaciones. [12]
Este método se ha mejorado desde entonces, pero estos métodos más precisos son complejos. El estimador de máxima verosimilitud Ma-Sandri-Sarkar es actualmente el estimador más conocido . [13] Se han descrito varios métodos y estimaciones adicionales a partir de datos experimentales. [14]
Dos aplicaciones web para el cálculo de la tasa de mutación están disponibles gratuitamente: Falcor [10] y bz-rates . Bz-rates implementa una versión generalizada del estimador de máxima verosimilitud Ma-Sandri-Sarkar que puede tener en cuenta la tasa de crecimiento diferencial relativa entre células mutantes y de tipo salvaje, así como un estimador de función generadora que puede estimar tanto la tasa de mutación como la tasa de crecimiento. tasa de crecimiento diferencial. Un ejemplo trabajado se muestra en este artículo de Jones et al . [15]
Distribución
En todos estos modelos se asumió que la tasa de mutación ( μ ) y la tasa de crecimiento ( β ) eran constantes. El modelo se puede generalizar fácilmente para relajar estas y otras limitaciones. [16] Es probable que estas tasas difieran en entornos no experimentales. Los modelos también requieren que N t μ >> 1 donde N t es el número total de organismos. Es probable que esta suposición se mantenga en los entornos más realistas o experimentales.
Luria y Delbrück [4] estimaron la tasa de mutación a partir de la ecuación
donde β es la tasa de crecimiento celular, n 0 es el número inicial de bacterias en cada cultivo, t es el tiempo y
donde N s es el número de cultivos sin bacterias resistentes y N es el número total de cultivos.
El modelo de Lea y Coulson [11] difería del original en que consideraban una colección de procesos de Yule independientes (un proceso de Poisson filtrado ). Las comparaciones numéricas de estos dos modelos con valores realistas de los parámetros han demostrado que difieren solo ligeramente. [17] La función generadora para este modelo fue encontrada por Bartlett en 1978 [18] y es
donde μ es la tasa de mutación (que se supone constante), φ = 1 - e - βt con β como la tasa de crecimiento celular (también se supone que es constante) y t como el tiempo.
La determinación de μ a partir de esta ecuación ha resultado difícil, pero en 2005 se descubrió una solución [ cita requerida ] . La diferenciación de la función generadora con respecto a μ permite la aplicación del método de Newton-Raphson que junto con el uso de una función de puntuación permite obtener intervalos de confianza para μ .
Biología Molecular
El mecanismo de resistencia al fago T1 parece deberse a mutaciones en el gen fhu A, una proteína de membrana que actúa como receptor T1. [19] El producto del gen ton B también es necesario para la infección por T1. La proteína FhuA está activamente involucrada en el transporte de ferricromo , albomicina y rifamicina . [20] También confiere sensibilidad a la microcina J25 y la colicina M y actúa como receptor de los fagos T5 y phi80, así como de T1.
La proteína FhuA tiene un dominio de barril beta (residuos 161 a 714) que está cerrado por un dominio de corcho globular (residuos 1 a 160). [21] Dentro del dominio del corcho se encuentra la región de unión de TonB (residuos 7 a 11). Los grandes dominios de barril β monoméricos que atraviesan la membrana tienen 22 hebras β de longitud variable, varias de las cuales se extienden significativamente más allá del núcleo hidrófobo de la membrana hacia el espacio extracelular. Hay 11 bucles extracelulares numerados de L1 a L11. El bucle L4 es donde se une el fago T1.
Referencias
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enlaces externos
- En el laboratorio de mutaciones
- Perfiles en ciencia: los documentos de Salvador E. Luria Información sobre Salvador Luria de la Biblioteca Nacional de Medicina