El método de Miles y Misra (o recuento de viables de superficie) es una técnica utilizada en microbiología para determinar el número de unidades formadoras de colonias en una suspensión u homogeneizado bacteriano . La técnica fue descrita por primera vez en 1938 por Miles, Misra e Irwin, que en ese momento trabajaban en LSHTM . [1] Se ha demostrado que el método de Miles y Misra es preciso. [2]
Materiales
- Una pipeta de goteo calibrada , o una pipeta automática, que administra gotas de 20 μl.
- Placas de Petri que contienen agar nutritivo u otro medio apropiado.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otro diluyente apropiado.
- Suspensión bacteriana u homogeneizado.
Método
- El inóculo / suspensión se diluye en serie agregando 1x de suspensión a 9x de diluyente. Cuando se desconoce la cantidad de bacterias, se deben realizar diluciones de al menos 10 −8 .
- Se necesitan tres placas para cada serie de diluciones, por razones estadísticas se necesita un promedio de al menos 3 recuentos.
- La superficie de las placas debe estar lo suficientemente seca para permitir que se absorba una gota de 20 μl en 15-20 minutos.
- Las placas se dividen en sectores iguales (es posible utilizar hasta 8 por placa). Los sectores están etiquetados con las diluciones.
- En cada sector, se deja caer 1 x 20 μl de la dilución apropiada sobre la superficie del agar y se deja que la gota se extienda de forma natural. En la descripción original del método, una caída desde una altura de 2,5 cm se extiende sobre un área de 1,5-2,0 cm. Es importante evitar tocar la superficie del agar con la pipeta.
- Las placas se dejan en posición vertical sobre la mesa para que se sequen antes de invertirlas e incubarlas a 37 ° C durante 18-24 horas (o condiciones de incubación apropiadas teniendo en cuenta el organismo y el agar utilizado).
- Se observa el crecimiento de cada sector, las concentraciones altas darán un crecimiento confluente sobre el área de la gota, o una gran cantidad de colonias pequeñas / fusionadas. Las colonias se cuentan en el sector donde se puede ver el mayor número de colonias discretas de tamaño completo (normalmente se cuentan los sectores que contienen entre 2 y 20 colonias).
- La siguiente ecuación se utiliza para calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml de la alícuota / muestra original:
- UFC por ml = Número medio de colonias para una dilución x 50 x factor de dilución .
Ventajas
- Más rápido que otros métodos.
- Produce menos contaminación bacteriana de la superficie de trabajo.
Ver también
Referencias
- ^ Miles, AA; Misra, SS; Irwin, JO (noviembre de 1938). "La estimación del poder bactericida de la sangre" . La Revista de Higiene . 38 (6): 732–49. doi : 10.1017 / s002217240001158x . PMC 2199673 . PMID 20475467 .
- ^ Hedges, AJ (25 de junio de 2002). "Estimación de la precisión de diluciones seriadas y recuentos bacterianos viables". Revista Internacional de Microbiología de Alimentos . 76 (3): 207-14. doi : 10.1016 / s0168-1605 (02) 00022-3 . PMID 12051477 .