Un marcador de tamaño-peso molecular , también referido como una proteína de escalera , ADN escalera , o ARN escalera , es un conjunto de estándares que se utilizan para identificar el aproximada tamaño de una molécula de ejecución en un gel durante la electroforesis , utilizando el principio de que molecular el peso es inversamente proporcional a la tasa de migración a través de una matriz de gel. Por lo tanto, cuando se utilizan en electroforesis en gel , los marcadores proporcionan efectivamente una escala logarítmica. mediante el cual estimar el tamaño de los otros fragmentos (siempre que se conozcan los tamaños de los fragmentos del marcador).
Los marcadores de proteínas, ADN y ARN con tamaños y concentraciones de fragmentos predeterminados están disponibles comercialmente. Estos pueden procesarse en geles de agarosa o poliacrilamida . Los marcadores se cargan en carriles adyacentes a los carriles de muestra antes del comienzo de la ejecución.
Marcadores de ADN
Desarrollo
Aunque se ha mantenido el concepto de marcadores de peso molecular, las técnicas de desarrollo han variado a lo largo de los años. Los nuevos inventos de marcadores de peso molecular se distribuyen en kits específicos para el tipo de marcador.
Un problema temprano en el desarrollo de marcadores fue lograr una alta resolución en toda la longitud del marcador. [1] Dependiendo de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis en gel, es posible que los fragmentos se hayan comprimido, alterando la claridad. Para abordar este problema, en 1990 se desarrolló un kit para el análisis Southern Blot , que proporciona el primer marcador que combina el ADN diana y el ADN de la sonda. Esta técnica aprovechó el espaciado logarítmico y podría usarse para identificar bandas objetivo que abarcan una longitud de 20.000 nucleótidos . [2]
Diseño
Hay dos métodos comunes para construir un marcador de tamaño de peso molecular de ADN. [3] Uno de estos métodos emplea la técnica de ligadura parcial . [3] La ligadura de ADN es el proceso mediante el cual las piezas lineales de ADN se conectan entre sí mediante enlaces covalentes ; más específicamente, estos enlaces son enlaces fosfodiéster . [4] Aquí, una pieza de ADN dúplex de 100 pb está parcialmente ligada. La consecuencia de esto es que se formarán dímeros de 200 pb, trímeros de 300 pb, tetrámeros de 400 pb, pentámeros de 500 pb, etc. Además, quedará una parte del dsDNA de 100 pb. Como resultado, se crea en el gel una "escalera" de ADN compuesta de trozos de ADN de masa molecular conocida . [3]
El segundo método emplea el uso de enzimas de restricción y una secuencia de ADN reconocida. [3] El ADN es digerido por una enzima de restricción particular, lo que resulta en fragmentos de ADN de masas moleculares variables. Una de las ventajas de este método es que se pueden crear fácilmente más marcadores simplemente digiriendo más ADN conocido. [3] Por otro lado, el tamaño de las piezas de ADN se basa en los sitios donde corta la enzima de restricción. Esto hace que sea más difícil controlar el tamaño de los fragmentos en el marcador. [5]
Más recientemente, los laboratorios están empleando otro método para construir marcadores de tamaño de peso molecular de ADN. Esta estrategia implica el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . [5] Esto se logra de una o dos formas: 1) una diana de ADN se amplifica al mismo tiempo mediante conjuntos de cebadores , o 2) diferentes blancos de ADN se amplifican de forma independiente a través de cebadores particulares. [5]
Efectos de las condiciones del gel
Al igual que con las muestras experimentales, las condiciones del gel pueden afectar el marcador de tamaño de peso molecular que corre junto a ellas. Factores como el búfer , la carga / voltaje y la concentración de gel pueden afectar la movilidad y / o apariencia de su marcador / escalera / estándar. Estos elementos deben tenerse en cuenta al seleccionar un marcador y al analizar los resultados finales en un gel.
- Amortiguadores
- Los tampones actúan para 1) establecer el pH y 2) proporcionar iones para mantener la conductividad. En la electroforesis de ADN , los tampones de elección habituales son TAE (Tris-acetato-EDTA) y TBE (Tris-borato-EDTA) . [6] Se prefiere el tampón TBE para piezas pequeñas de ADN, mientras que TAE es más adecuado para fragmentos de más de 1500 pares de bases. En términos de capacidad de almacenamiento intermedio, TAE es menor en comparación con TBE; esto generalmente da como resultado una movilidad más lenta del ADN. TBE también es capaz de una mejor resolución. [7]
- Debe tenerse en cuenta que el agua no puede actuar como sustituto de uno de estos tampones, ya que el ADN no migrará a lo largo del gel. [6] Además, el uso de agua en lugar de tampón hará que el gel se derrita . [8]
- Carga / Voltaje
- En términos de voltaje, el rango recomendado está entre 4 y 10 V / cm (es decir, voltios / cm). [8] Los geles de agarosa generalmente se procesan a un voltaje de 5 V / cm. [3] [6] La unidad de distancia, cm , se refiere a la distancia entre los electrodos (es decir, el ánodo y el cátodo ) y no la longitud del gel en sí. [3] [6]
- Los voltajes demasiado por debajo o por encima de este rango afectarán la movilidad y la resolución de las bandas. Los voltajes bajos disminuirán la movilidad y harán que las bandas se ensanchen. Por otro lado, los altos voltajes disminuirán la resolución de las bandas. Esto se debe en gran parte al hecho de que los voltajes demasiado altos pueden hacer que el gel se sobrecaliente e incluso se derrita. [8]
- Concentración
- Se debe tener en cuenta la concentración de agarosa al seleccionar un marcador. El porcentaje de gel afecta la migración del ADN. [3] [6] Generalmente, cuanto mayor sea la concentración de gel, más lenta será la velocidad a la que el ADN se moverá a través del gel. Esto se suma al papel que juega el peso molecular en la migración de un marcador o muestra de ADN, es decir, que cuanto mayor sea el peso molecular, más lentamente migrará el ADN. [3] [6]
- La concentración de gel también afecta la capacidad de visualizar las bandas que se agotan en el gel. Las bandas más pequeñas se resuelven mejor en un gel de mayor porcentaje, mientras que las bandas de mayor peso molecular se visualizan más fácilmente en un gel de menor porcentaje. [6]
Marcadores de proteínas
Desarrollo
Anteriormente, los marcadores de proteínas se habían desarrollado utilizando una variedad de proteínas completas. El desarrollo de un kit que incluye un marcador de tamaño de peso molecular basado en fragmentos de proteína comenzó en 1993. Este marcador de proteína, compuesto por 49 secuencias de aminoácidos diferentes , incluía proteínas multidominio y permitió el análisis de proteínas escindidas en diferentes sitios. [9]
Las mejoras técnicas actuales en los marcadores de proteínas implican el uso de autodesarrollo. El primer marcador de proteínas de peso regular desarrollado automáticamente se inventó en 2012. [10]
Diseño
Al igual que los marcadores de ADN, estos marcadores se componen típicamente de proteínas purificadas cuyas masas moleculares ya se conocen. [3] La siguiente lista describe algunas de las proteínas, así como la masa molecular, que se utilizan comúnmente al construir un marcador de proteínas.
Proteína | Masa molecular ( kDa ) |
Beta-galactosidasa | 120 [11] |
Fosforilasa B | 94 [3] [12] |
Albúmina de suero bovino (BSA) | 67 [3] [12] |
Ovoalbúmina | 43 [3] |
Albúmina de pavo | 40 [12] |
Anhídrido carbónico | 30 [3] [12] |
Inhibidor de tripsina de soja | 20,1 [3] [12] |
a-lactoalbúmina | 14.4 [3] [12] |
Lisozima | 14 [13] |
Elegir el marcador de proteínas correcto
Los marcadores de tamaño de peso molecular se pueden dividir en dos categorías: marcadores de peso molecular frente a marcadores de escalera molecular. [14] Los marcadores están teñidos o sin teñir, y dependiendo de las circunstancias, uno puede ser más apropiado que otro. Los marcadores de tamaño de peso molecular también se pueden alterar bioquímicamente. [15] La conjugación con biotina es la más común. Los marcadores de tamaño de peso molecular se utilizan con mayor frecuencia en la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y la transferencia Western . Con todos los diferentes tipos y usos de los marcadores de tamaño de peso molecular, es importante elegir el estándar de proteína apropiado. Además del uso más común, como una forma de calcular el peso molecular de las muestras, otros usos incluyen permitir evidencia visual de la migración de proteínas y la eficiencia de transferencia y, a veces, incluso se utilizan para el control positivo. [dieciséis]
- Marcador de MW vs Escaleras de proteínas
- Un marcador de peso molecular es un tipo de patrón de proteína. Pueden teñirse o no teñirse antes de la carga; dependiendo del tipo de experimento, uno puede ser más ventajoso. En cualquier caso, normalmente se procesan en el carril exterior de un gel, mientras que la muestra se carga en los carriles del medio. [14] Los marcadores moleculares se diferencian de las escalas de proteínas en que están compuestos por una mezcla de proteínas nativas cuyas especificaciones están bien categorizadas pero no corresponden a números enteros. [14] Generalmente, estos son mucho más baratos, pero el análisis solo permite un valor aproximado de las proteínas separadas por electroforesis. [14]
- Una escalera de proteínas es otro tipo de estándar de proteínas. Casi siempre están manchadas. [14] Las escaleras de proteínas se diferencian de los marcadores moleculares en que están compuestas por una mezcla de proteínas altamente purificadas cuyas especificaciones son conocidas y corresponden a números enteros. [14] Generalmente, las escaleras de proteínas se componen de 10-12 proteínas. [14] Al final del experimento, después de que ocurra la migración de tamaño, una sola banda representará el tamaño de cada proteína contenida en la escalera. [17] Los marcadores están espaciados uniformemente, y el análisis de tamaño utilizando estos marcadores permite un valor preciso de la proteína de interés. En algunos casos, como método de confirmación molecular, los marcadores de MW se ejecutan con escalas de proteínas para su verificación. [14]
- Marcadores sin tinción y sin tinción
- Los marcadores de proteínas pueden venir sin teñir o teñidos, pero ambos tienen sus ventajas y desventajas. [18] La visualización simple de la separación y transferencia de proteínas es posible mediante el uso de marcadores pretintados. [18] Se utilizan comúnmente tanto en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS como en transferencia Western. En SDS-PAGE, permite el seguimiento de la migración de proteínas, ya que las bandas de proteínas se separarán y se podrán ver durante una corrida electroforética. En las transferencias de Western, los patrones de proteínas teñidos permiten la transferencia de proteínas de visualización a la membrana. [17] Sin embargo, las determinaciones de tamaño no son tan precisas con estos marcadores (consulte la sección de marcadores naturales y recombinantes para obtener más información). [18]
- Si bien los marcadores no teñidos permiten determinaciones de tamaño más exactas, no se pueden ver mientras el gel está funcionando. Como tal, el gel debe teñirse para poder visualizar las bandas. [19]
- Marcadores naturales y recombinantes
- Además de los marcadores teñidos y sin teñir, los marcadores de proteínas se pueden considerar en términos de recombinantes y naturales. [18] Los marcadores recombinantes consisten en proteínas recombinantes que se han purificado en gran medida. Estos marcadores están diseñados de tal manera que resalten características particulares. [18] Ejemplos de estas características incluyen etiquetas de afinidad y pesos moleculares que están colocados uniformemente entre sí. [18]
- Los marcadores naturales, como su nombre lo indica, son una mezcla de proteínas que se producen de forma natural. [18] Los marcadores naturales preteñidos funcionan bien para la visualización de la separación del gel. Sin embargo, estos marcadores tienden a unirse a la mancha de manera covalente en cantidades variables y en varias posiciones. [18] En consecuencia, las bandas resultantes pueden ser más amplias. Esto es especialmente cierto cuando se hacen comparaciones con marcadores recombinantes preteñidos. Debido a este efecto, es probable que las determinaciones del peso molecular sean menos precisas con los marcadores naturales teñidos previamente. [18]
- Alterado bioquímicamente
- Los estándares de proteínas también se pueden alterar químicamente. Una alteración común es mediante el uso de biotina . La biotina tiene una afinidad muy alta por la estreptavidina y, por lo tanto, la unión forma un complejo muy fuerte. Para la visualización, se adjunta una etiqueta de color a la estreptavidina. [15]
Efectos de las condiciones del gel
Al igual que con la electroforesis de ADN, deben tenerse en cuenta condiciones tales como tampones, carga / voltaje y concentración al seleccionar un marcador de proteína.
- Amortiguadores
- Los búferes pueden afectar la movilidad tanto del marcador como de las muestras. El pH del tampón varía con el sistema utilizado y, en consecuencia, cada sistema tampón tendrá un efecto diferente de la carga de una proteína o proteínas. [20] Además, en el caso de SDS-PAGE, la afinidad de unión por SDS puede verse afectada por el sistema de almacenamiento en búfer. [20] Incluso cuando se usa el mismo porcentaje y tipo de gel, las mismas proteínas migrarán a diferentes velocidades dependiendo del tampón usado. [20]
- Carga / Voltaje
- El voltaje juega un papel en la movilidad de las proteínas en un gel. Las proteínas migrarán más rápido a voltajes más altos. En consecuencia, el tiempo de funcionamiento del gel será más corto. Por el contrario, voltajes más altos pueden resultar en una mayor difusión de banda. [20] Además, si el voltaje es demasiado alto, la temperatura en la cámara de electroforesis puede llegar a ser tal que el gel comience a derretirse. [20]
- El voltaje al que se debe ejecutar un gel depende del tipo de gel. Para algunos geles, el voltaje permanece constante durante todo el ciclo, mientras que, con otros geles, se permite que el voltaje inicial permanezca constante durante un tiempo específico antes de que aumente. [20] Este segundo voltaje se usa luego durante un período de tiempo específico, después del cual, también se puede aumentar. [20]
- Concentración
- En términos de porcentaje, los geles utilizados para la electroforesis de proteínas se pueden descomponer en geles de un solo porcentaje y geles en gradiente. [18] Los geles de un solo porcentaje también se denominan geles lineales. [20] Para los geles lineales, el porcentaje seleccionado suele estar entre el 7,5% y el 20%. [18] Los rangos de porcentaje comunes para los geles en gradiente son 4-15% y 10-20%. Cada tipo de gel tiene sus propias ventajas. [18] Por ejemplo, se prefieren los geles lineales cuando varias proteínas tienen pesos moleculares similares; una mejor separación entre estas proteínas se mostrará mediante un gel lineal. [18] Por otro lado, los geles de gradiente son una mejor opción cuando las muestras de interés contienen proteínas de pesos moleculares muy diferentes o que cubren una amplia gama de pesos moleculares. [18] [20]
Marcadores de ARN
Desarrollo
Las escaleras de ARN compuestas de marcadores de tamaño de peso molecular de ARN se desarrollaron inicialmente utilizando el método del círculo sintético [21] para producir marcadores de diferentes tamaños. Esta técnica fue mejorada por el inventor Eric T. Kool para usar vectores de ADN circulares como un método para producir marcadores de tamaño de peso molecular de ARN. Conocido como el método del círculo rodante, las mejoras de esta técnica se derivan de su eficacia en la síntesis de oligonucleótidos de ARN . A partir de la plantilla de ADN circular, se puede producir ARN monocatenario que varía en longitud de 4-1500 pb sin la necesidad de cebadores y reciclando el nucleótido trifosfato . El ADN también se puede sintetizar a partir de la plantilla circular, lo que aumenta la versatilidad de esta técnica. En comparación con la transcripción de escorrentía , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin escorrentía. En comparación con la PCR , el método del círculo sintético produce oligonucleótidos de ARN sin la necesidad de polimerasa ni de un termociclador . Este método también es rentable en su capacidad de sintetizar grandes cantidades de producto con una tasa de error más baja que los sintetizadores de máquina. [21]
Diseño
Los marcadores de ARN consisten en transcripciones de ARN de varias longitudes incrementales. Por ejemplo, el marcador Lonza 0.5-9 kbp [22] tiene bandas que marcan 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6 y 9 kilopares de bases. Los marcadores se disuelven en un tampón de almacenamiento, como EDTA , y pueden tener una vida útil de hasta 2 años cuando se almacenan a -80 ° C. Para usar el marcador, como para el análisis de transferencia Northern, primero se descongela y luego se tiñe para que sea detectable en una electroforesis en gel. Uno de los tintes más comunes que se utilizan para los marcadores es el bromuro de etidio .
El rango de un marcador en particular se refiere a la variedad de bandas que puede mapear. Un rango "alto" se refiere a fragmentos relativamente grandes (medidos en kb) mientras que un rango "bajo" se refiere a marcadores que distinguen entre fragmentos pequeños (medidos en pb). Algunos marcadores pueden incluso describirse como de "rango ultrabajo", [16] pero aún más preciso es el marcador de microARN. Se puede usar un marcador de microARN para medir fragmentos de ARN dentro de una docena de nucleótidos, como el marcador de microARN de 17-25 nt. [23]
Usar
A pesos moleculares equivalentes, el ARN migrará más rápido que el ADN. Sin embargo, tanto el ARN como el ADN tienen una pendiente lineal negativa entre su distancia de migración y su peso molecular logarítmico . [24] Es decir, las muestras de menor peso pueden migrar a una mayor distancia. Esta relación es una consideración al elegir marcadores de ARN o ADN como estándar.
Cuando se procesan marcadores de ARN y muestras de ARN en un gel, es importante prevenir la contaminación por nucleasa , ya que el ARN es muy sensible a la degradación de la ribonucleasa (ARNasa) mediante catálisis . [25] [26] Por lo tanto, se deben tener en cuenta todos los materiales que se utilizarán en el procedimiento. Cualquier material de vidrio que entre en contacto con ARN debe tratarse previamente con dietilpirocarbonato (DEPC) y los materiales plásticos deben ser desechables. [25]
Marcadores de tamaño de peso molecular y SDS-PAGE
Uno de los usos más comunes de los marcadores de tamaño de peso molecular es la electroforesis en gel. El propósito de la electroforesis en gel es separar proteínas por propiedades físicas o químicas , que incluyen carga, tamaño molecular y pH .
Los geles pueden variar en tamaño. El número de muestras que se analizarán determinará el tamaño de gel adecuado. Todos los geles se dividen en carriles que corren paralelos a través del gel. Cada carril contendrá una muestra específica. Normalmente, los patrones de tamaño de peso molecular se colocan en un carril exterior. Si un gel tiene un número particularmente alto de carriles, entonces se pueden colocar varias escaleras a lo largo del gel para una mayor claridad.
Las proteínas y los estándares se pipetean en el gel en las pistas adecuadas. El dodecilsulfato de sodio (SDS) interactúa con las proteínas, desnaturalizándolas y dándoles una carga negativa. Dado que todas las proteínas tienen la misma relación carga-masa, la movilidad de las proteínas a través del gel se basará únicamente en el peso molecular. Una vez que se enciende el campo eléctrico, se iniciará la migración de proteínas. Una vez finalizado, se puede utilizar un mecanismo de detección como el Western Blot, que revelará la presencia de bandas. Cada banda representa una proteína específica. La distancia de viaje se basa únicamente en el peso molecular; por lo tanto, el peso molecular de cada proteína se puede determinar comparando la distancia de una proteína desconocida con el estándar de peso molecular conocido. [27]
Diferentes usos de los marcadores de tamaño de peso molecular
Existen muchos tipos de marcadores de tamaño de peso molecular, y cada uno posee características únicas, lo que hace que participen en una serie de técnicas biológicas. La selección de un marcador de tamaño de peso molecular depende del tipo de marcador (ADN, ARN o proteína) y el rango de longitud que ofrece (por ejemplo, 1 kb). Antes de seleccionar un marcador de tamaño de peso molecular, es importante familiarizarse con estas características y propiedades. En un caso particular, un tipo puede ser más apropiado que otro. Aunque los marcadores específicos pueden variar entre los protocolos para una técnica determinada, esta sección describirá los marcadores generales y sus funciones.
Alozimas
El primer tipo de marcador molecular desarrollado y ejecutado en electroforesis en gel fueron las aloenzimas . Estos marcadores se utilizan para la detección de variaciones de proteínas. La palabra "alozima" (también conocida como "aloenzima") proviene de " variantes alélicas de enzimas ". [28] Cuando se procesan en gel, las proteínas se separan por tamaño y carga. Aunque las aloenzimas pueden parecer anticuadas en comparación con los otros marcadores disponibles, todavía se usan hoy en día, principalmente debido a su bajo costo. Una desventaja importante es que, dado que solo hay una cantidad limitada disponible, la especificidad es un problema. [28]
Marcadores basados en ADN (década de 1960)
Aunque las aloenzimas pueden detectar variaciones en el ADN, es por un método indirecto y no muy preciso. Los marcadores basados en ADN se desarrollaron en la década de 1960. [28] Estos marcadores son mucho más efectivos para distinguir entre variantes de ADN. Hoy en día, estos son los marcadores más utilizados. Los marcadores basados en ADN funcionan examinando los nucleótidos, que pueden cumplir una variedad de funciones, como detectar diferencias en los nucleótidos o incluso cuantificar el número de mutaciones . [28]
- RFLP
- El polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción es una técnica utilizada para detectar variaciones en el ADN homólogo . [29] Se utilizan endonucleasas de restricción específicas para digerir el ADN. El marcador molecular RFLP es específico de un solo fragmento. Junto con los marcadores RFLP aléicos, también se incluye un marcador de tamaño de peso molecular, en este caso un marcador de ADN, [30] en un gel de agarosa electroforesizado . El marcador de ADN permite estimar el tamaño de los fragmentos de restricción.
- Minisatélites
- Al igual que RFLP, esta técnica también utiliza endonucleasas de restricción para digerir el ADN genómico. Los minisatélites son secuencias cortas de repeticiones en tándem, aproximadamente de 10 a 60 pares de bases. Los minisatélites se pueden utilizar en la huella de ADN y como reguladores del control de genes. [28]
Marcadores basados en PCR (década de 1980)
El éxito de los marcadores basados en ADN condujo al desarrollo de la PCR. La PCR ( reacción en cadena de la polimerasa ) es una técnica de amplificación de ADN que se puede aplicar a varios tipos de fragmentos. Antes de este desarrollo, para amplificar el ADN, era necesario clonarlo o aislarlo. Poco después del descubrimiento de la PCR surgió la idea de utilizar marcadores basados en PCR para la electroforesis en gel. Este tipo de marcadores se basan en cebadores de PCR y se clasifican como polimorfismo de secuencia de ADN . [28]
- Microsatélites
- También conocidos como SSR ( repeticiones de secuencia simple ) o STR ( repeticiones cortas en tándem ), los microsatélites se diferencian de los minisatélites en que son más cortos, generalmente de 2 a 6 pares de bases. Esta propiedad de los microsatélites permite un fácil aislamiento. Los microsatélites se utilizan con mayor frecuencia en genética de poblaciones . Los microsatélites tienen una tasa de mutación alta y compleja, que es su principal desventaja. [28]
- AFLP
- El polimorfismo de longitud de fragmento amplificado es una técnica de huellas dactilares de ADN basada en PCR . El ADN se digiere primero con endonucleasas. A continuación, los fragmentos de restricción se ligan entre sí. [31] Luego se genera un marcador molecular cuando se seleccionan fragmentos específicos para amplificación . Los marcadores AFLP se ejecutan junto con un marcador de ADN en un gel. Un marcador de ADN AFLP común tiene una longitud de 30-330 pb. [32] Los fragmentos de este marcador se encuentran a intervalos de 10 pb para aumentar la precisión.
- RAPD
- El ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica que se realiza de manera similar a la AFLP. La diferencia es que los marcadores moleculares se generan al azar. [31] El marcador de tamaño de peso molecular más común para esta técnica es la escalera de ADN de 1 kb. [33] [34]
Polimorfismo de secuencia de ADN
Aunque técnicamente hablando, el polimorfismo de la secuencia de ADN ha estado ocurriendo desde el uso de RFLP en la década de 1960, el análisis ha cambiado significativamente a lo largo de los años. El polimorfismo de secuencia de ADN utiliza técnicas más antiguas como RFLP, pero a mayor escala. La secuenciación es mucho más rápida y eficiente. El análisis está automatizado, ya que utiliza una técnica conocida como secuenciación de escopeta. Este método de alto rendimiento se usa comúnmente en genética de poblaciones. [28]
- SNP
- Los SNP ( polimorfismo de un solo nucleótido ) se utilizan para detectar variaciones en un solo nucleótido. La técnica es muy similar a la del RFLP. Los SNP se utilizan con frecuencia para estudios genéticos de poblaciones. [35] Después de la amplificación mediante PCR, estos pequeños fragmentos se pueden visualizar mediante electroforesis en gel y, nuevamente, los marcadores de ADN desempeñan un papel en la determinación de la longitud del fragmento.
Análisis de polisacáridos por electroforesis en gel de carbohidratos
Los marcadores de carbohidratos se emplean en una técnica conocida como análisis de polisacáridos por electroforesis en gel de carbohidratos (PACE), que es una técnica de separación medible. [36] Permite el análisis de productos de hidrólisis enzimática . [36] Se ha utilizado en aplicaciones como la caracterización de enzimas implicadas en la degradación de la hemicelulosa , la determinación de la estructura de los polisacáridos de hemicelulosa y el análisis de la escisión enzimática de productos de celulosa . [36]
PACE depende de la derivatización, que es la conversión de un compuesto químico en un derivado . [36] [37] Aquí los compuestos de interés son los monosacáridos , oligosacáridos y polisacáridos. Están etiquetados en sus extremos reductores con una etiqueta fluorescente (es decir, un fluoróforo ). [36] Esta derivatización con un fluoróforo permite tanto la separación en un gel en las circunstancias deseadas como la formación de imágenes de fluorescencia del gel. En este caso, se utiliza un gel de poliacrilamida. [36]
Al igual que con la electroforesis de ADN, ARN y proteínas, los marcadores se procesan junto con las muestras de interés en la electroforesis en gel de carbohidratos. [36] Los marcadores consisten en oligosacáridos de peso molecular conocido. Al igual que las muestras de interés, el marcador también se deriva con un fluoróforo (generalmente con ácido 8-amino naftaleno -1,3,6 - trisulfónico (ANTS) o 2- aminoacridona ). [36]
Referencias
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