La transfección óptica es el proceso de introducir ácidos nucleicos en las células utilizando luz. Normalmente, un láser se enfoca en un punto de difracción limitada (~ 1 µm de diámetro) utilizando un objetivo de microscopio de alta apertura numérica . La membrana plasmática de una célula se expone después a esta luz altamente enfocado para una pequeña cantidad de tiempo (típicamente decenas de milisegundos a segundos), generando un poro transitorio en la membrana. La generación de un fotoporo permite plásmidos exógenos de ADN , ARN , fluoróforos orgánicos u objetos más grandes, como nanopuntos cuánticos semiconductores.para entrar en la celda. En esta técnica, se trata una célula a la vez, lo que la hace particularmente útil para el análisis de células individuales.
En pocas palabras, las células no suelen permitir que ciertos tipos de sustancias entren en su espacio interior. Los láseres se pueden utilizar para quemar un pequeño agujero en la superficie de la célula, permitiendo que esas sustancias entren. Esto es tremendamente útil para los biólogos que están estudiando enfermedades, ya que un requisito experimental común es poner cosas (como ADN) en las células.
Esta técnica fue demostrada por primera vez en 1984 por Tsukakoshi et al., Quienes utilizaron una frecuencia de Nd: YAG triplicada para generar una transfección estable y transitoria de células renales normales de rata. [1] Desde entonces, la transfección óptica de una gran cantidad de tipos de células de mamíferos se ha demostrado utilizando una variedad de fuentes láser, incluida la onda continua de 405 nm (cw), [2] 488 nm cw, [3] o fuentes pulsadas . como el Ti: Zafiro pulsado con femtosegundos de 800 nm [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] o Nd: YAG pulsado de nanosegundos de 1064 nm. [14] [15]
Terminología
El significado del término transfección ha evolucionado. [16] El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir , la introducción de ADN (o ARN) de un virus o bacteriófago que infecta a los procariotas en las células, lo que da como resultado una infección. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología de células animales (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de cambio en la célula. propiedades causadas por la introducción de ADN (u otras especies de ácidos nucleicos como ARN o SiARN ).
Debido a esta definición estricta de transfección , la transfección óptica también se refiere solo a la introducción de especies de ácido nucleico. La introducción de otros compuestos impermeables en una célula, como fluoróforos orgánicos o nanopuntos cuánticos semiconductores, no es estrictamente hablando "transfección" y, por lo tanto, se denomina "inyección óptica" o uno de los muchos otros términos que se describen a continuación.
La falta de un nombre unificado para esta tecnología dificulta mucho la revisión de la literatura sobre el tema. [17] La inyección óptica se ha descrito utilizando más de una docena de nombres o frases diferentes (consulte las listas con viñetas a continuación). Algunas tendencias en la literatura son claras. El primer término de la técnica es invariablemente una derivación de la palabra láser, óptico o foto, y el segundo término suele hacer referencia a inyección, transfección, poro, perforación o punción. Al igual que muchas perturbaciones celulares, cuando una sola célula o grupo de células se trata con un láser, pueden suceder tres cosas: la célula muere (sobredosis), la membrana celular se permeabiliza, las sustancias ingresan y la célula se recupera (dosis terapéutica), o no pasa nada (infradosis). Ha habido sugerencias en la literatura para reservar el término optoinyección para cuando se administra una dosis terapéutica en una sola célula, [18] [19] [20] y el término optoporación para cuando una onda de choque generada por láser trata un grupo de muchas (10s a 100) celdas. [18] [19] [14] [20] La primera definición de optoinyección no es controvertida. Sin embargo, la definición de optoporación no ha sido adoptada, con un número similar de referencias que utilizan el término para denotar la dosificación de células individuales [3] [5] [15] [21] como los que utilizan el término para denotar la dosificación de grupos de muchas células [18] [19] [14] [20]
Tal como está el campo, es la opinión de los autores de un artículo de revisión sobre el tema [17] que el término optoinyección siempre se incluirá como palabra clave en futuras publicaciones, independientemente de sus propias preferencias de nomenclatura.
Términos acordados por consenso
- Optoinyección (o cualquier derivación de la inyección láser, la inyección óptica, la fotoinyección): la transferencia de cualquier sustancia impermeable a la membrana a una célula utilizando luz. Un término general que también abarca la transfección óptica.
- Transfección óptica (o cualquier derivación de la transfección láser, optotransfección, fototransfección): un tipo específico de transfección óptica: la transferencia de ácidos nucleicos a una célula utilizando luz con el fin de provocar la traducción de proteínas a partir de esos ácidos. Para estar en consonancia con la definición actual de transfección en la comunidad biológica, los ácidos no nucleicos (como los fluoróforos) no pueden, por definición, transfectarse ópticamente (solo inyectarse ópticamente).
- Fotoporación (o cualquier derivación de [láser-] u [óptico-] u [opto-] o [foto-] Y [poro] o [-permeabilización] o [-punción] o [-perforación]): La generación de una Agujero o agujeros transitorios en la membrana plasmática (o pared celular) de una célula, generalmente con el propósito de inyección óptica. Ver posible excepción: Optoporación
- -cirugía (como nanocirugía celular, nanocirugía láser, cirugía láser): término general que incorpora todas las definiciones anteriores, pero también incluye los conceptos de ablación o manipulación óptica del material celular para otros fines además de la generación de poros. Los ejemplos incluyen la ablación celular selectiva para purificar poblaciones celulares, disección de cromosomas, alteración del citoesqueleto, ablación de orgánulos, axotomía, [22] o la depilación óptica o aislamiento de material intracelular.
Términos bajo deliberación
- Optoporación : se ha sugerido que significa la dosificación de un grupo de células con un mecanismo mediado por ondas de choque, que generalmente da como resultado una zona terapéutica en forma de rosquilla. [18] [19] [14] [20] Por el contrario, también se ha utilizado como sinónimo del término fotoporación. [3] [5] [15] [21]
- Infección por láser : se ha sugerido que significa la dosificación de un grupo de células con una zona terapéutica de forma circular. Término reservado para el sistema de procesamiento y análisis habilitado por láser (LEAP) de Cyntellect.
- Transporte transmembrana convectivo inducido por la luz : un término recién acuñado para la optoinyección. [23]
Parte de lo anterior se reprodujo con permiso de. [17]
Métodos
Un protocolo típico de transfección óptica es el siguiente: [11] 1) Construya un sistema de pinzas ópticas con un objetivo de NA alto 2) Cultive las células hasta una confluencia del 50-60% 3) Exponga las células a al menos 10 µg / ml de ADN plasmídico 4) Dosifique la membrana plasmática de cada célula con 10-40 ms de láser enfocado, a una potencia de <100 mW en el foco 5) Observe la transfección transitoria 24-96 h después 6) Agregue medio selectivo si se desea la generación de colonias estables
Ver también
- Transfección
- Transformación
- Transducción
- Liposoma catiónico
- Nucleofección
- Transfección asistida por imán
Referencias
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enlaces externos
- Investigación en transfección óptica en la Universidad de St Andrews
- Transfección en los títulos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Descripción general de los métodos de transfección en Nature Methods 2, 875 - 883 (2005)