El mapeo óptico [1] es una técnica para construir mapas de restricción de alta resolución ordenados en todo el genoma a partir de moléculas de ADN teñidas individuales, llamadas "mapas ópticos". Al mapear la ubicación de los sitios de las enzimas de restricción a lo largo del ADN desconocido de un organismo, el espectro de fragmentos de ADN resultantes sirve colectivamente como una "huella digital" o "código de barras" único para esa secuencia. Desarrollado originalmente por el Dr. David C. Schwartz y su laboratorio en NYU en la década de 1990 [2], este método ha sido parte integral del proceso de ensamblaje de muchos proyectos de secuenciación a gran escala para genomas microbianos y eucariotas. Las tecnologías posteriores utilizan la fusión del ADN, [3] la unión competitiva del ADN [4] o el etiquetado enzimático [5].[6] para crear las asignaciones ópticas.
Tecnología
La moderna plataforma de cartografía óptica funciona de la siguiente manera: [7]
- El ADN genómico se obtiene a partir de células lisadas y se corta al azar para producir una "biblioteca" de moléculas genómicas grandes para el mapeo óptico.
- Una sola molécula de ADN se estira (o alarga) y se mantiene en su lugar en un portaobjetos bajo un microscopio fluorescente debido a las interacciones de carga.
- La molécula de ADN es digerida por enzimas de restricción agregadas, que se escinden en sitios de digestión específicos. Los fragmentos de moléculas resultantes permanecen unidos a la superficie. Los extremos del fragmento en los sitios de escisión se retraen (debido a la elasticidad del ADN linealizado), dejando espacios que son identificables bajo el microscopio.
- Los fragmentos de ADN teñidos con colorante intercalante se visualizan mediante microscopía de fluorescencia y se dimensionan midiendo la intensidad de fluorescencia integrada. Esto produce un mapa óptico de moléculas individuales.
- Los mapas ópticos individuales se combinan para producir un mapa óptico genómico de consenso.
Historia de la plataforma de mapeo óptico
Sistema temprano
Las moléculas de ADN se fijaron en agarosa fundida desarrollada entre un cubreobjetos y un portaobjetos de microscopio. La enzima de restricción se mezcló previamente con la agarosa fundida antes de la colocación del ADN y se desencadenó la escisión mediante la adición de magnesio.
Usando superficies cargadas
En lugar de inmovilizarse dentro de una matriz de gel, las moléculas de ADN se mantuvieron en su lugar mediante interacciones electrostáticas en una superficie cargada positivamente. La resolución mejoró de tal manera que los fragmentos de ~ 30 kb a tan pequeños como 800 bp pudieron dimensionarse.
Sistema automático
Esto implicó el desarrollo e integración de un sistema de detección automatizado para detectar múltiples moléculas individuales en un portaobjetos (como un microarray) para el procesamiento enzimático paralelo, microscopía de fluorescencia automatizada para la adquisición de imágenes, visión de procesión de imágenes para manejar imágenes, algoritmos para la construcción de mapas ópticos, agrupación informática para procesar grandes cantidades de datos
Sistema de alto rendimiento que utiliza microfluidos
Al observar que los microarrays manchados con moléculas individuales no funcionaban bien para grandes moléculas de ADN genómico, se desarrollaron dispositivos de microfluidos que usaban litografía blanda que poseían una serie de microcanales paralelos.
Sistema de próxima generación que utiliza tecnología de nanocodificación
Una mejora en el mapeo óptico, llamada "Nanocodificación", [8] tiene el potencial de aumentar el rendimiento al atrapar moléculas de ADN alargadas en nanoconfinamientos.
Comparaciones
Otras técnicas de mapeo
La ventaja de la OM sobre las técnicas de mapeo tradicionales es que conserva el orden del fragmento de ADN, mientras que el orden debe reconstruirse mediante mapeo de restricción . Además, dado que los mapas se construyen directamente a partir de moléculas de ADN genómico, se evitan los artefactos de clonación o PCR. Sin embargo, cada proceso de OM todavía se ve afectado por sitios falsos positivos y negativos porque no todos los sitios de restricción se escinden en cada molécula y algunos sitios pueden cortarse incorrectamente. En la práctica, se crean múltiples mapas ópticos a partir de moléculas de la misma región genómica y se utiliza un algoritmo para determinar el mejor mapa de consenso. [9]
Otros métodos de análisis del genoma
Existe una variedad de enfoques para identificar variaciones genómicas a gran escala (como indeles, duplicaciones, inversiones, translocaciones) entre genomas. Otras categorías de métodos incluyen el uso de microarrays , electroforesis en gel de campo pulsado , citogenética y etiquetas de extremos emparejados .
Usos
Inicialmente, el sistema de mapeo óptico se ha utilizado para construir mapas de restricción del genoma completo de bacterias, parásitos y hongos. [10] [11] [12] También se ha utilizado para estructurar y validar genomas bacterianos. [13] Para servir como andamios para el ensamblaje, los contigs de secuencia ensamblados se pueden escanear en busca de sitios de restricción in silico utilizando datos de secuencia conocidos y alineándolos con el mapa óptico genómico ensamblado. La empresa comercial Opgen ha proporcionado mapeos ópticos para genomas microbianos. Para genomas eucariotas más grandes, solo el laboratorio de David C. Schwartz (ahora en Madison-Wisconsin) ha producido mapas ópticos para ratón, [14] humanos, [15] arroz, [16] y maíz. [17]
Secuenciación óptica
La secuenciación óptica es una técnica de secuenciación de ADN de una sola molécula que sigue secuencia por síntesis y utiliza tecnología de mapeo óptico. [18] [19] Similar a otros enfoques de secuenciación molecular única como la secuenciación SMRT , esta técnica analiza una sola molécula de ADN, en lugar de amplificar la muestra inicial y secuenciar múltiples copias del ADN. Durante la síntesis, los nucleótidos marcados con fluorocromos se incorporan mediante el uso de ADN polimerasas y se rastrean mediante microscopía de fluorescencia . Esta técnica fue propuesta originalmente por David C. Schwartz y Arvind Ramanathan en 2003.
Ciclo de secuenciación óptica
La siguiente es una descripción general de cada ciclo en el proceso de secuenciación óptica. [20]
Paso 1: código de barras de ADN
Las células se lisan para liberar ADN genómico. Estas moléculas de ADN se desenredan, se colocan en una superficie de mapeo óptico que contiene canales de microfluidos y se permite que el ADN fluya a través de los canales. Estas moléculas son luego codificadas por enzimas de restricción para permitir la localización genómica a través de la técnica de mapeo óptico. Consulte la sección anterior sobre "Tecnología" para conocer esos pasos.
Paso 2:
Se agrega ADNasa I de corte de plantilla para cortar aleatoriamente las moléculas de ADN montadas. A continuación, se realiza un lavado para eliminar la ADNasa I. El número medio de mellas que se producen por molde depende de la concentración de ADNasa I así como del tiempo de incubación.
Paso 3:
Se agrega exonucleasa T7 de formación de huecos, que utiliza los cortes en las moléculas de ADN para expandir los huecos en una dirección 5'-3 '. La cantidad de exonucleasa T7 debe controlarse cuidadosamente para evitar niveles excesivamente altos de roturas bicatenarias.
Paso 4: La
ADN polimerasa de incorporación de fluorocromo se utiliza para incorporar nucleótidos marcados con fluorocromo (FdNTP) en los múltiples sitios con huecos a lo largo de cada molécula de ADN. Durante cada ciclo, la mezcla de reacción contiene un solo tipo de FdNTP y permite múltiples adiciones de ese tipo de nucleótidos. A continuación, se realizan varios lavados para eliminar los fdNTP no incorporados en preparación para la formación de imágenes y el siguiente ciclo de adición de FdNTP.
Paso 5: obtención de imágenes
Este paso cuenta el número de nucleótidos marcados con fluorocromo incorporados en las regiones de brecha utilizando microscopía de fluorescencia.
Paso 6: Fotoblanqueo
La iluminación láser que se usa para excitar el fluorocromo también se usa aquí para destruir la señal del fluorocromo. Esto esencialmente restablece el contador de fluorocromo y prepara el contador para el siguiente ciclo. Este paso es un aspecto único de la secuenciación óptica, ya que en realidad no elimina la etiqueta de fluorocromo del nucleótido después de su incorporación. no quitar la etiqueta de fluorocromo hace que la secuenciación sea más económica, pero da como resultado la necesidad de incorporar etiquetas de fluorocromo consecutivamente, lo que puede resultar en problemas debido al volumen de las etiquetas.
Paso 7: Repita los pasos 4 a
6 Los pasos 4 a 6 se repiten con el paso 4 utilizando una mezcla de reacción que contiene un nucleótido marcado con fluorocromo diferente (FdNTP) cada vez. Esto se repite hasta que se secuencia la región deseada.
Estrategias de optimización
La selección de una ADN polimerasa adecuada es fundamental para la eficacia del paso de adición de base y debe cumplir varios criterios:
- Capacidad para incorporar de manera eficiente FdNTP en posiciones consecutivas
- Falta de exonucleasa 3'-5 'y actividad de corrección de pruebas para evitar la eliminación del FdNTP recién incorporado
- Alta fidelidad para minimizar las malas incorporaciones
- Buena actividad en plantillas que se montan en superficies (por ejemplo, superficie de mapeo óptico)
Además, la diferente preferencia de la polimerasa por diferentes fluorocromos, la longitud del conector en los nucleótidos de fluorocromo y las composiciones de tampón también son factores importantes a considerar para optimizar el proceso de adición de bases y maximizar el número de incorporaciones consecutivas de FdNTP.
Ventajas
Análisis de
una sola molécula Dado que se requiere una muestra mínima de ADN, se evita el costoso y lento paso de amplificación para agilizar el proceso de preparación de la muestra.
Plantillas de moléculas de ADN grandes (~ 500 kb) frente a plantillas de moléculas de ADN cortas (<1 kb) Si bien la mayoría de las tecnologías de secuenciación de próxima generación tienen como objetivo cantidades masivas de lecturas de secuencias pequeñas, estas lecturas de secuencias pequeñas dificultan la comprensión de los esfuerzos de secuenciación de novo y las regiones de repetición del genoma . La secuenciación óptica utiliza plantillas de moléculas de ADN grandes (~ 500 kb) para la secuenciación y estas ofrecen varias ventajas sobre las plantillas pequeñas:
- Estas grandes plantillas de ADN pueden tener un "código de barras de ADN" para determinar su localización genómica con confianza. Por lo tanto, cualquier lectura de secuencia que se tome de la plantilla grande se puede mapear en el genoma con un alto grado de confianza. Más importante aún, las lecturas de secuencia de regiones de alta repetición se pueden colocar con un mayor grado de confianza, mientras que las lecturas cortas sufren de incertidumbre en el mapeo en regiones de alta repetición. Se han desarrollado algoritmos y software especiales, como el mapeo óptico y la nanocodificación, para alinear códigos de barras de una sola molécula con un genoma de referencia.
- Múltiples lecturas de secuencia de la misma molécula de plantilla grande. Estas lecturas de secuencias múltiples reducen la complejidad del ensamblaje de novo, eliminan la ambigüedad de las regiones de reordenamiento genómico y "están intrínsecamente libres de errores de ensamblaje". [20]
- El código de barras molecular de grandes plantillas moleculares de ADN con adquisición de secuencias proporciona análisis genómicos amplios y específicos
Desventajas
- La secuenciación de ADN de una sola molécula requiere un alto nivel de precisión para igualar la confianza de la cobertura de lectura redundante proporcionada por las tecnologías de secuenciación actuales de próxima generación.
- Muescas en ambas cadenas en posiciones similares que dan como resultado una plantilla baja durante secuencia por síntesis.
- Los nucleótidos marcados con fluorocromo no se eliminan después de la incorporación y, debido a estos voluminosos marcadores, la incorporación múltiple puede resultar difícil.
Referencias
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enlaces externos
- Soluciones de mapeo óptico OpGen
- Laboratorio Dr. David C. Schwartz