La replicación del ADN procariota es el proceso mediante el cual un procariota duplica su ADN en otra copia que se transmite a las células hijas. [1] Aunque a menudo se estudia en el organismo modelo E. coli , otras bacterias muestran muchas similitudes. [2] La replicación es bidireccional y se origina en un solo origen de replicación (OriC). [3] Consta de tres pasos: inicio, alargamiento y terminación. [4]
Iniciación
Todas las células deben terminar la replicación del ADN antes de que puedan proceder a la división celular. Las condiciones de los medios que apoyan el crecimiento rápido en bacterias también se combinan con un tiempo de inter-iniciación más corto en ellas, es decir, el tiempo de duplicación en células de crecimiento rápido es menor en comparación con el crecimiento lento. [5] En otras palabras, es posible que en condiciones de crecimiento rápido las células de la abuela comiencen a replicar su ADN para la célula nieta. Por la misma razón, el inicio de la replicación del ADN está altamente regulado. Los orígenes bacterianos regulan el ensamblaje del orisoma, un complejo núcleo-proteína ensamblado en el origen responsable de desenrollar el origen y cargar toda la maquinaria de replicación. En E. coli, la dirección para el ensamblaje del orisoma se construye en un tramo corto de secuencia de nucleótidos llamado origen de replicación ( oriC ) que contiene múltiples sitios de unión para la proteína iniciadora DnaA [6] (una proteína altamente homóloga entre el reino bacteriano). DnaA tiene cuatro dominios y cada dominio es responsable de una tarea específica. [7] Hay 11 recuadros / sitios de unión de DnaA en el origen de replicación de E. coli [6] de los cuales tres recuadros R1, R2 y R4 (que tienen una secuencia consenso de 9 pb altamente conservada 5 '- TTATC / ACACA [2 ] ) son cajas de DnaA de alta afinidad. Se unen a DnaA-ADP y DnaA-ATP con afinidades iguales y están unidos por DnaA durante la mayor parte del ciclo celular y forman un andamio en el que se ensambla el resto del orisoma. Las ocho cajas restantes de DnaA son sitios de baja afinidad que se unen preferentemente a DnaA-ATP. [6] Durante la iniciación, el DnaA unido a la caja R4 de DnaA de alta afinidad dona DnaA adicional al sitio adyacente de baja afinidad y llena progresivamente todas las cajas de DnaA de baja afinidad. [6] El llenado de los sitios cambia la conformación de origen de su estado nativo. Se ha planteado la hipótesis de que el estiramiento del ADN por el DnaA unido al origen promueve la separación de las hebras, lo que permite que más DnaA se una a la región desenrollada. [8] El cargador de helicasa DnaC luego interactúa con el DnaA unido al ADN monocatenario para reclutar la helicasa DnaB , [9] que continuará desenrollando el ADN a medida que la primasa DnaG establece un cebador de ARN y comienza la holoenzima de la ADN polimerasa III. alargamiento. [10]
Regulación
La replicación cromosómica en bacterias está regulada en la etapa de iniciación. [2] DnaA-ATP es hidrolizado en el inactivo DnaA-ADP por RIDA (Regulatory Inactivación de DnaA), [11] y convertido de nuevo a la forma activa de DnaA-ATP por DARS (DnaA Reactivating Sequence, que a su vez está regulado por Fis y IHF). [12] [13] Sin embargo, la principal fuente de DnaA-ATP es la síntesis de nuevas moléculas. [2] Mientras tanto, varias otras proteínas interactúan directamente con la secuencia oriC para regular la iniciación, generalmente por inhibición. En E. coli, estas proteínas incluyen DiaA, [14] SeqA , [15] IciA, [2] HU, [9] y ArcA-P, [2] pero varían entre otras especies bacterianas. Algunos otros mecanismos en E. coli que regulan de forma diversa la iniciación son DDAH ( hidrólisis de DnaA dependiente de datA, que también está regulada por IHF), [16] inhibición del gen dnaA (por la proteína SeqA), [2] y reactivación de DnaA por la membrana lipídica. [17]
Alargamiento
Una vez que se completa el cebado, la holoenzima de la ADN polimerasa III se carga en el ADN y comienza la replicación. El mecanismo catalítico de la ADN polimerasa III implica el uso de dos iones metálicos en el sitio activo y una región en el sitio activo que puede discriminar entre desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . Los iones metálicos son cationes divalentes generales que ayudan al 3 'OH a iniciar un ataque nucleofílico sobre el alfa fosfato del desoxirribonucleótido y orientan y estabilizan el trifosfato cargado negativamente en el desoxirribonucleótido. El ataque nucleofílico del 3 'OH sobre el alfa fosfato libera pirofosfato , que posteriormente se hidroliza (mediante fosfatasa inorgánica) en dos fosfatos. Esta hidrólisis impulsa la síntesis de ADN hasta su finalización.
Además, la ADN polimerasa III debe poder distinguir entre bases correctamente emparejadas y bases incorrectamente emparejadas. Esto se logra distinguiendo los pares de bases de Watson-Crick mediante el uso de un bolsillo de sitio activo que tiene una forma complementaria a la estructura de los nucleótidos emparejados correctamente. Este bolsillo tiene un residuo de tirosina que puede formar interacciones de van der Waals con el nucleótido emparejado correctamente. Además, el dsDNA ( ADN bicatenario ) en el sitio activo tiene un surco mayor más ancho y un surco menor menos profundo que permite la formación de enlaces de hidrógeno con el tercer nitrógeno de las bases de purina y el segundo oxígeno de las bases de pirimidina . Finalmente, el sitio activo forma extensos enlaces de hidrógeno con la columna vertebral del ADN. Estas interacciones dan como resultado que la ADN polimerasa III se cierre alrededor de una base correctamente emparejada. Si se inserta una base y se empareja incorrectamente, estas interacciones no podrían ocurrir debido a interrupciones en los enlaces de hidrógeno y las interacciones de van der Waals.
El ADN se lee en la dirección 3 '→ 5', por lo tanto, los nucleótidos se sintetizan (o se unen a la hebra molde ) en la dirección 5 '→ 3'. Sin embargo, una de las cadenas originales de ADN es 3 '→ 5' mientras que la otra es 5 '→ 3'. Para resolver esto, la replicación ocurre en direcciones opuestas. Dirigiéndose hacia la bifurcación de replicación, la hebra principal se sintetiza de forma continua y solo requiere un cebador. Por otro lado, la hebra rezagada , que se aleja de la bifurcación de replicación, se sintetiza en una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki, por lo que requieren muchos cebadores. Los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki son posteriormente degradados por la ARNasa H y la ADN polimerasa I ( exonucleasa ), y los huecos (o muescas ) se rellenan con desoxirribonucleótidos y se sellan con la enzima ligasa .
Tasa de replicación
La tasa de replicación del ADN en una célula viva se midió primero como la tasa de elongación del ADN del fago T4 en E. coli infectada con fagos. [18] Durante el período de aumento exponencial del ADN a 37 ° C, la tasa fue de 749 nucleótidos por segundo. La tasa de mutación por par de bases por replicación durante la síntesis de ADN del fago T4 es de 1,7 por 108 . [19]
Terminación
La terminación de la replicación del ADN en E. coli se completa mediante el uso de secuencias de terminación y la proteína Tus . Estas secuencias permiten que las dos bifurcaciones de replicación pasen en una sola dirección, pero no en la otra.
La replicación del ADN produce inicialmente dos dúplex de ADN circulares enlazados o catenados, cada uno de los cuales comprende una hebra parental y una hebra recién sintetizada (por la naturaleza de la replicación semiconservadora ). Esta catenación se puede visualizar como dos anillos interconectados que no se pueden separar. La topoisomerasa 2 en E. coli desvincula o decatena los dos dúplex circulares de ADN rompiendo los enlaces fosfodiéster presentes en dos nucleótidos sucesivos del ADN original o del ADN recién formado y, posteriormente, la actividad de ligadura liga esa hebra de ADN rota y así se forman los dos ADN.
Otros modelos de replicación procariota
La replicación del tipo theta ya se ha mencionado. Hay otros tipos de replicación procariota, como la replicación de círculo rodante y la replicación de bucle D
Replicación del círculo rodante
Esto se ve en la conjugación bacteriana donde el mismo ADN de plantilla circulante rota y alrededor de él se desarrolla la nueva hebra.
. Cuando la conjugación es iniciada por una señal, la enzima relaxasa crea una muesca en una de las hebras del plásmido conjugativo en el oriT . La relaxasa puede funcionar sola o en un complejo de más de una docena de proteínas conocidas colectivamente como relaxosoma . En el sistema del plásmido F, la enzima relaxasa se llama TraI y el relaxosoma consta de TraI, TraY, TraM y el factor huésped integrado IHF. La hebra mellada, o hebra T , se desenrolla entonces de la hebra no rota y se transfiere a la célula receptora en una dirección del extremo 5 'al extremo 3'. La hebra restante se replica independientemente de la acción conjugativa (la replicación vegetativa comienza en el oriV ) o en concierto con la conjugación (replicación conjugativa similar a la replicación en círculo rodante del fago lambda ). La replicación conjugativa puede requerir una segunda mella antes de que pueda ocurrir una transferencia exitosa. Un informe reciente afirma haber inhibido la conjugación con sustancias químicas que imitan un paso intermedio de este segundo evento de mella. [20]
Replicación de bucle D
La replicación del bucle D se observa principalmente en el ADN organelar, donde se forma una estructura de triple cadena llamada bucle de desplazamiento . [21]
Referencias
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