Microarreglo de proteínas
Una micromatriz de proteínas (o chip de proteínas ) es un método de alto rendimiento que se utiliza para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas, y para determinar su función y determinar la función a gran escala. [1] Su principal ventaja radica en el hecho de que se puede rastrear un gran número de proteínas en paralelo. El chip consta de una superficie de soporte, como un portaobjetos de vidrio, una membrana de nitrocelulosa, una perla o una placa de microtitulación , a la que se une una serie de proteínas de captura. [2] Las moléculas de sonda , normalmente marcadas con un tinte fluorescente, se agregan a la matriz. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que es leída por un escáner láser. [3] Los microarreglos de proteínas son rápidos, automatizados, económicos y altamente sensibles, y consumen pequeñas cantidades de muestras y reactivos. [4] El concepto y la metodología de los microarreglos de proteínas se introdujeron e ilustraron por primera vez en los microarreglos de anticuerpos (también conocidos como matriz de anticuerpos ) en 1983 en una publicación científica [5] y una serie de patentes. [6] La tecnología de alto rendimiento detrás de la micromatriz de proteínas fue relativamente fácil de desarrollar, ya que se basa en la tecnología desarrollada para las micromatrices de ADN , [7] que se han convertido en las micromatrices más utilizadas .
Las micromatrices de proteínas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de micromatrices de ADN para determinar los niveles de expresión génica en proteómica . La cantidad de ARNm en la célula muchas veces no refleja los niveles de expresión de las proteínas a las que corresponden. Dado que generalmente es la proteína, en lugar del ARNm, la que tiene el papel funcional en la respuesta celular, se necesitaba un enfoque novedoso. Además , las modificaciones postraduccionales , que a menudo son críticas para determinar la función de la proteína, no son visibles en los microarrays de ADN. [8] Los microarreglos de proteínas reemplazan las técnicas proteómicas tradicionales, como la electroforesis en gel 2D o la cromatografía ., que requerían mucho tiempo, mucha mano de obra y no eran adecuados para el análisis de proteínas poco abundantes.
Las proteínas se disponen sobre una superficie sólida, como portaobjetos de microscopio, membranas, perlas o placas de microtitulación. La función de esta superficie es proporcionar un soporte sobre el cual se pueden inmovilizar las proteínas. Debe demostrar propiedades de unión máximas, manteniendo la proteína en su conformación nativa para que se conserve su capacidad de unión. Los portaobjetos de microscopio hechos de vidrio o silicona son una opción popular, ya que son compatibles con los arrays robóticos y escáneres láser de fácil obtención que se han desarrollado para la tecnología de microarrays de ADN. Los portaobjetos de película de nitrocelulosa son ampliamente aceptados como el sustrato de mayor unión a proteínas para aplicaciones de micromatrices de proteínas.
A continuación, la superficie sólida elegida se cubre con un revestimiento que debe cumplir las funciones simultáneas de inmovilizar la proteína, evitar su desnaturalización , orientarla en la dirección adecuada para que sus sitios de unión sean accesibles y proporcionar un entorno hidrofílico en el que pueda llevarse a cabo la reacción de unión . ocurrir. También necesita mostrar un enlace no específico mínimo para minimizar el ruido de fondo en los sistemas de detección. Además, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Los agentes inmovilizadores incluyen capas de aluminio u oro, polímeros hidrofílicos y geles de poliacrilamida , o tratamiento con aminas , aldehído o epoxi . Tecnologías de película delgada comoLa deposición física de vapor (PVD) y la deposición química de vapor (CVD) se emplean para aplicar el recubrimiento a la superficie de soporte.
Un entorno acuoso es esencial en todas las etapas de la fabricación y el funcionamiento de la matriz para evitar la desnaturalización de las proteínas. Por lo tanto, los tampones de muestra contienen un alto porcentaje de glicerol (para reducir el punto de congelación) y la humedad del entorno de fabricación se regula cuidadosamente. Los micropocillos tienen la doble ventaja de proporcionar un entorno acuoso y, al mismo tiempo, evitar la contaminación cruzada entre muestras.
