Una micromatriz de anticuerpos (también conocida como matriz de anticuerpos ) es una forma específica de micromatriz de proteínas . En esta tecnología, una colección de anticuerpos capturados se mancha y fija en una superficie sólida como vidrio, plástico, membrana o chip de silicio, y se detecta la interacción entre el anticuerpo y su antígeno diana. Las micromatrices de anticuerpos se utilizan a menudo para detectar la expresión de proteínas de varios biofluidos que incluyen suero, plasma y lisados de células o tejidos. Las matrices de anticuerpos pueden usarse tanto para investigación básica como para aplicaciones médicas y de diagnóstico. [1] [2] [3] [4]
Fondo
El concepto y la metodología de los microarrays de anticuerpos fueron introducidos por primera vez por Tse Wen Chang en 1983 en una publicación científica [5] y una serie de patentes, [6] [7] [8] cuando trabajaba en Centocor en Malvern, Pensilvania . Chang acuñó el término "matriz de anticuerpos" y discutió la disposición de la "matriz" de pequeñas manchas de anticuerpos en pequeñas superficies de vidrio o plástico. Demostró que se podía colocar una cuadrícula de 10 × 10 (100 en total) y 20 × 20 (400 en total) de manchas de anticuerpos en una superficie de 1 × 1 cm. También estimó que si un anticuerpo se recubre a una concentración de 10 μg / ml, que es óptima para la mayoría de los anticuerpos, 1 mg de anticuerpo puede producir 2.000.000 de puntos de 0,25 mm de diámetro. La invención de Chang se centró en el empleo de micromatrices de anticuerpos para la detección y cuantificación de células que portan ciertos antígenos de superficie, como antígenos CD y antígenos alotípicos HLA , antígenos particulados, como virus y bacterias, y antígenos solubles. El principio de "aplicación de una muestra, múltiples determinaciones", configuración de ensayo y mecánica para colocar puntos absorbentes descritos en el documento y las patentes deberían ser generalmente aplicables a diferentes tipos de micromatrices . Cuando Tse Wen Chang y Nancy T. Chang estaban estableciendo Tanox , Inc. en Houston, Texas en 1986, compraron los derechos sobre las patentes de matriz de anticuerpos de Centocor como parte de la base tecnológica para construir su nueva startup. Su primer producto en desarrollo fue un ensayo, denominado "citometría inmunoabsorbente", [9] que podría emplearse para controlar el estado inmunológico, es decir, las concentraciones y proporciones de células T CD3 + , CD4 + y CD8 + en la sangre. de las personas infectadas por el VIH .
Los antecedentes teóricos de los ensayos de unión de ligandos basados en microarrays de proteínas fueron desarrollados por Roger Ekins y sus colegas a fines de la década de 1980. [10] [11] [12] Según el modelo, los microarrays de anticuerpos no solo permitirían el cribado simultáneo de un panel de analitos, sino que también serían más sensibles y rápidos que los métodos de cribado convencionales. El interés en la detección de grandes conjuntos de proteínas solo surgió como resultado de los logros en genómica de los microarrays de ADN y el Proyecto Genoma Humano .
Los primeros enfoques de matriz intentaron miniaturizar los ensayos bioquímicos e inmunobiológicos que normalmente se realizan en placas de microtitulación de 96 pocillos. Si bien las matrices de anticuerpos basadas en placas de 96 pocillos tienen una capacidad de alto rendimiento, la pequeña superficie de cada pocillo limita el número de manchas de anticuerpos y, por tanto, el número de analitos detectados. Otros soportes sólidos, como portaobjetos de vidrio y membranas de nitrocelulosa, se utilizaron posteriormente para desarrollar matrices que pudieran acomodar paneles más grandes de anticuerpos. [13] Las matrices basadas en membranas de nitrocelulosa son flexibles, fáciles de manipular y tienen una mayor capacidad de unión a proteínas, pero son menos susceptibles de procesamiento automático o de alto rendimiento. Los portaobjetos de vidrio químicamente derivatizados permiten la impresión de manchas de anticuerpos de tamaño inferior a un microlitro, lo que reduce el área de superficie de la matriz sin sacrificar la densidad de las manchas. Esto a su vez reduce el volumen de muestra consumida. Las matrices basadas en portaobjetos de vidrio, debido a su estructura suave y rígida, también se pueden instalar fácilmente en sistemas de manipulación de líquidos de alto rendimiento.
La mayoría de los sistemas de matrices de anticuerpos emplean 1 de 2 métodos de inmunodetección no competitivos: detección de un solo anticuerpo (basada en etiquetas) y detección de 2 anticuerpos (basada en sándwich). El último método, en el que la detección de analitos requiere la unión de 2 anticuerpos distintos (un anticuerpo de captura y un anticuerpo indicador, cada uno de los cuales se une a un epítopo único), confiere una mayor especificidad y una señal de fondo más baja en comparación con la inmunodetección basada en marcadores (donde solo 1 captura se utiliza el anticuerpo y la detección se logra marcando químicamente todas las proteínas en la muestra inicial). Las matrices de anticuerpos en sándwich generalmente alcanzan la mayor especificidad y sensibilidad (niveles ng - pg) de cualquier formato de matriz; su reproducibilidad también permite realizar análisis cuantitativos. [14] [15] Debido a la dificultad de desarrollar pares de anticuerpos coincidentes que sean compatibles con todos los demás anticuerpos en el panel, las matrices pequeñas a menudo utilizan un enfoque de sándwich. Por el contrario, las matrices de alta densidad son más fáciles de desarrollar a un costo menor utilizando el enfoque basado en un único anticuerpo. En esta metodología, se utiliza un conjunto de anticuerpos específicos y todas las proteínas de una muestra se marcan directamente con tintes fluorescentes o haptenos.
Los usos iniciales de los sistemas de matrices basados en anticuerpos incluyeron la detección de IgG y subclases específicas, [16] [17] análisis de antígenos, [18] detección de anticuerpos recombinantes , [19] [20] estudio de proteína quinasas de levadura, [21] análisis de anticuerpos autoinmunes, [ 22] y examinar las interacciones proteína-proteína. [23] [24] [25] El primer enfoque para detectar simultáneamente múltiples citocinas de muestras fisiológicas usando tecnología de matriz de anticuerpos fue el de Ruo-Pan Huang y sus colegas en 2001. [26] Su enfoque utilizó membranas Hybond ECL para detectar un pequeño panel de 24 citocinas de medios acondicionados de cultivo celular y sueros de pacientes y pudieron perfilar la expresión de citocinas a niveles fisiológicos. Huang tomó esta tecnología y comenzó un nuevo negocio, RayBiotech, Inc., el primero en comercializar con éxito una matriz de anticuerpos planar.
En los últimos diez años, la sensibilidad del método mejoró mediante una optimización de la química de la superficie, así como protocolos específicos para su etiquetado químico. [27] Actualmente, la sensibilidad de las matrices de anticuerpos es comparable a la de ELISA [28] [29] y las matrices de anticuerpos se utilizan regularmente para realizar experimentos de perfiles en muestras de tejido, muestras de plasma o suero y muchos otros tipos de muestras. Un enfoque principal en los estudios de perfiles basados en matrices de anticuerpos es el descubrimiento de biomarcadores, específicamente para el cáncer. [30] [31] [32] [33] [34] Para la investigación relacionada con el cáncer, en 2010 se informó el desarrollo y la aplicación de una matriz de anticuerpos que comprende 810 anticuerpos diferentes relacionados con el cáncer. [35] También en 2010, un anticuerpo Se utilizó una matriz que comprende 507 citocinas, quimiocinas, adipocinas, factores de crecimiento, factores angiogénicos, proteasas, receptores solubles, moléculas de adhesión solubles y otras proteínas para cribar el suero de pacientes con cáncer de ovario e individuos sanos y se encontró una diferencia significativa en la expresión de proteínas entre y muestras de cáncer. [36] Más recientemente, las matrices de anticuerpos han ayudado a determinar proteínas séricas específicas relacionadas con la alergia cuyos niveles están asociados con el glioma y pueden reducir el riesgo años antes del diagnóstico. [37] La elaboración de perfiles de proteínas con matrices de anticuerpos también ha demostrado su eficacia en áreas distintas de la investigación del cáncer, específicamente en enfermedades neurológicas como el Alzheimer. Varios estudios han intentado identificar paneles de biomarcadores que puedan distinguir a los pacientes de Alzheimer, y muchos han utilizado matrices de anticuerpos en este proceso. Jaeger y sus colegas midieron casi 600 proteínas circulatorias para descubrir vías biológicas y redes afectadas en el Alzheimer y exploraron las relaciones positivas y negativas de los niveles de esas proteínas y redes individuales con el desempeño cognitivo de los pacientes con Alzheimer. [38] Actualmente, la matriz de anticuerpos basada en sándwich más grande disponible comercialmente detecta 1000 proteínas diferentes. [39] Además, se encuentran disponibles servicios de elaboración de perfiles de proteínas basados en microarrays de anticuerpos que analizan la abundancia de proteínas y el estado de fosforilación o ubiquitinilación de proteínas 1030 en paralelo. [40]
Las matrices de anticuerpos se utilizan a menudo para detectar la expresión de proteínas de muchos tipos de muestras, pero también en aquellas con diversas preparaciones. Jiang y sus colegas ilustraron muy bien la correlación entre la expresión de proteínas de matriz en dos preparaciones de sangre diferentes: suero y gotas de sangre seca. [41] Estas diferentes preparaciones de muestras de sangre se analizaron utilizando tres plataformas de matriz de anticuerpos: basada en sándwich, cuantitativa y basada en etiquetas, y se encontró una fuerte correlación en la expresión de proteínas, lo que sugiere que las manchas de sangre seca, que son una forma más conveniente y segura y medios económicos para obtener sangre, especialmente en áreas de salud pública no hospitalizadas, se pueden utilizar de manera eficaz con el análisis de matrices de anticuerpos para el descubrimiento de biomarcadores, el perfil de proteínas y la detección, diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
Aplicaciones
El uso de microarrays de anticuerpos en diferentes áreas de diagnóstico médico ha atraído la atención de los investigadores. El bioensayo digital es un ejemplo de tales dominios de investigación. En esta tecnología, una serie de micropocillos en un chip de vidrio / polímero se siembran con perlas magnéticas (recubiertas con anticuerpos marcados con fluorescencia), se someten a antígenos dirigidos y luego se caracterizan mediante un microscopio mediante el recuento de los pocillos fluorescentes. Recientemente se ha demostrado una plataforma de fabricación rentable (que utiliza polímeros OSTE ) para tales matrices de micropocillos y se ha caracterizado con éxito el sistema de modelo de bioensayo . [42] Además, los inmunoensayos en andamios micropilares de "papel sintético" de tiol-eno han demostrado generar una señal de fluorescencia superior. [43]
Ver también
- ELISA
- Microarreglo de proteínas
- Micromatriz de ADN
- Micromatriz de tejido
- Microarreglo de compuestos químicos
- Impresión de microarrays y patrones de energía superficial
Referencias
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