Pst I es una endonucleasa de restricción de tipo IIaislada de la especie Gram negativa, Providencia stuartii .
Función
Pst I escinde el ADN en la secuencia de reconocimiento 5'-CTGCA / G-3 'generando fragmentos con extremos cohesivos 3'. [1] Esta escisión produce puntas pegajosas de 4 pares de bases de largo. PstI es catalíticamente activo como dímero. Las dos subunidades están relacionadas por un eje de simetría doble que en el complejo con el sustrato coincide con el eje de la díada de la secuencia de reconocimiento . Tiene un peso molecular de 69.500 y contiene 54 residuos con carga positiva y 41 con carga negativa. [2]
Secuencia de reconocimiento | Cortar sitio |
---|---|
5'CTGCAG 3 ' 3'GACGTC 5 ' | 5 '- CTGCA G - 3' 3 '- G ACGTC — 5' |
El sistema de restricción / modificación (R / M) de PstI tiene dos componentes: una enzima de restricción que escinde el ADN extraño y una metiltransferasa que protege las cadenas de ADN nativo mediante la metilación de histonas . La combinación de ambos proporciona un mecanismo de defensa contra los virus invasores. [3] La metiltransferasa y la endonucleasa están codificadas como dos proteínas separadas y actúan de forma independiente. En el sistema PstI, los genes están codificados en cadenas opuestas y, por tanto, deben transcribirse de forma divergente a partir de promotores separados . Los sitios de inicio de la transcripción están separados por solo 70 pares de bases . [4] Un retraso en la expresión de la endonucleasa en relación con la metilasa se debe a las diferencias inherentes de las dos proteínas. [5] La endonucleasa es un dímero, que requiere un segundo paso para el ensamblaje, mientras que la metilasa es un monómero.
PstI es funcionalmente equivalente a BsuBI. Ambas enzimas reconocen la secuencia diana 5'CTGCAG. Los sistemas enzimáticos tienen metiltransferasas similares (41% de identidad de aminoácidos), endonucleasas de restricción (46% de identidad de aminoácidos) y composición genética (58% de identidad de nucleótidos). [6] Estas observaciones sugieren una historia evolutiva compartida .
Al examinar la escisión preferencial de doble hebra del ADN, la endonucleasa de restricción PstI se une al ADN del plásmido pSM1. [7]
Clonación de ADN
PstI es una enzima útil para la clonación de ADN, ya que proporciona un sistema selectivo para generar moléculas de ADN híbridas. [8] Estas moléculas de ADN híbridas pueden luego escindirse en los sitios PstI regenerados. Su uso no se limita a la clonación molecular; también se utiliza en el mapeo de sitios de restricción, genotipificación, transferencia Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y SNP. [9] También es un isoesquizómero restricción SALPI enzima a partir de Streptomyces albus P . [10]
Escote
PstI escinde preferentemente el ADN de pSM1 purificado sin estar influenciado por la superhelicidad del sustrato. [11] Sin embargo, no se sabe si los efectos de esta escisión se producen al unirse al sitio de reconocimiento o la escisión del ADN. Sus tasas de escisión diferencial en diferentes sitios de restricción se deben a las cinco características de la estructura dúplex. La proximidad a los extremos en la molécula de ADN lineal, la variación en la secuencia de ADN dentro de los sitios de reconocimiento de enzimas, la corta distancia entre regiones de secuencias de ADN inusuales y sitios de reconocimiento y, por último, las estructuras especiales como bucles y horquillas. El efecto colectivo de estos cinco factores podría afectar la accesibilidad de la enzima de restricción a sus sitios de reconocimiento.
Relación
Referencias
- ^ "PstI (10 U / L) - Thermo Fisher Scientific" . www.thermofisher.com . Consultado el 29 de abril de 2016 .
- ^ Walder, RY; Walder, JA; Donelson, JE (25 de junio de 1984). "La organización y secuencia de nucleótidos completa del sistema de modificación de restricción PstI" . La revista de química biológica . 259 (12): 8015–8026. ISSN 0021-9258 . PMID 6330092 .
- ^ Walder, RY; Hartley, JL; Donelson, JE; Walder, JA (1 de marzo de 1981). "Clonación y expresión del sistema de modificación-restricción Pst I en Escherichia coli" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 78 (3): 1503–1507. Código Bibliográfico : 1981PNAS ... 78.1503W . doi : 10.1073 / pnas.78.3.1503 . ISSN 0027-8424 . PMC 319159 . PMID 6262807 .
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