Marcadores de ADN asociados al sitio de restricción
Los marcadores de ADN asociados a sitios de restricción (RAD) son un tipo de marcador genético que son útiles para el mapeo de asociaciones, mapeo de QTL , genética de poblaciones , genética ecológica y genética evolutiva. El uso de marcadores RAD para el mapeo genético a menudo se denomina mapeo RAD. Un aspecto importante de los marcadores y el mapeo RAD es el proceso de aislamiento de las etiquetas RAD, que son las secuencias de ADN que flanquean inmediatamente cada instancia de un sitio de restricción particular de una enzima de restricción en todo el genoma. [1] Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden usar para identificar y genotipar polimorfismos de secuencia de ADN principalmente en forma de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) .[1] Los polimorfismos que se identifican y genotipifican mediante el aislamiento y el análisis de etiquetas RAD se denominan marcadores RAD.
El uso de secuencias de ADN flanqueantes alrededor de cada sitio de restricción es un aspecto importante de las etiquetas RAD. [1] La densidad de las etiquetas RAD en un genoma depende de la enzima de restricción utilizada durante el proceso de aislamiento. [2] Existen otras técnicas de marcadores de sitios de restricción, como RFLP o polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP), que utilizan polimorfismo de longitud de fragmento causado por diferentes sitios de restricción, para la distinción de polimorfismo genético. El uso de las secuencias de ADN flanqueantes en las técnicas de etiqueta RAD se denomina método de representación reducida. [3]
El procedimiento inicial para aislar las etiquetas RAD implicaba digerir el ADN con una enzima de restricción particular, ligar los adaptadores biotinilados a los salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre los sitios de restricción y aislar los fragmentos biotinilados utilizando perlas de estreptavidina . [1] Este procedimiento se utilizó inicialmente para aislar etiquetas RAD para análisis de microarrays . [1] [4] [5] Más recientemente, el procedimiento de aislamiento de etiquetas RAD se ha modificado para su uso con secuenciación de alto rendimiento en la plataforma Illumina , que tiene el beneficio de tasas de error sin procesar muy reducidas y alto rendimiento.[2] El nuevo procedimiento implica digerir el ADN con una enzima de restricción particular (por ejemplo: SbfI, NsiI, ...), ligar el primer adaptador, llamado P1, a los salientes, cortando aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre sitios de restricción, preparando los extremos cortados en extremos romos y ligando el segundo adaptador (P2), y usando PCR para amplificar específicamente los fragmentos que contienen ambos adaptadores. Es importante destacar que el primer adaptador contiene un código de barras de secuencia de ADN corto, llamado MID (identificador molecular) que se utiliza como marcador para identificar diferentes muestras de ADN que se agrupan y secuencian en la misma reacción. [2] [6] El uso de secuenciación de alto rendimiento para analizar etiquetas RAD se puede clasificar como secuenciación de representación reducida, que incluye, entre otras cosas, RADSeq (secuenciación RAD). [3]
Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden usar para identificar y genotipar los polimorfismos de la secuencia de ADN, como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [1] [2] Estos sitios polimórficos se conocen como marcadores RAD. La forma más eficaz de encontrar etiquetas RAD es mediante la secuenciación de ADN de alto rendimiento , [2] [6] denominada secuenciación de etiquetas RAD, secuenciación RAD, RAD-Seq o RADSeq.
Antes del desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los marcadores RAD se identificaban mediante la hibridación de etiquetas RAD con microarrays. [1] [4] [5] Debido a la baja sensibilidad de los microarrays, este enfoque solo puede detectar polimorfismos de secuencia de ADN que interrumpen los sitios de restricción y conducen a la ausencia de etiquetas RAD o polimorfismos sustanciales de secuencia de ADN que interrumpen la hibridación de etiquetas RAD. Por lo tanto, la densidad de marcadores genéticos que se puede lograr con microarrays es mucho más baja que la que es posible con la secuenciación de ADN de alto rendimiento. [7]
