En bioquímica , la biotinilación es el proceso de unir covalentemente biotina a una proteína, ácido nucleico u otra molécula. La biotinilación es rápida, específica y es poco probable que altere la función natural de la molécula debido al pequeño tamaño de la biotina (PM = 244,31 g / mol). La biotina se une a la estreptavidina y avidina con una afinidad extremadamente alta, una velocidad de avance rápida y una alta especificidad, y estas interacciones se explotan en muchas áreas de la biotecnología para aislar moléculas de interés biotiniladas. La unión de biotina a estreptavidina y avidina es resistente a temperaturas extremas, pH y proteólisis, lo que hace posible la captura de moléculas biotiniladas en una amplia variedad de entornos. Además, múltiples biotinaLas moléculas se pueden conjugar con una proteína de interés, lo que permite la unión de múltiples moléculas de proteínas de estreptavidina , avidina o neutravidina y aumenta la sensibilidad de detección de la proteína de interés. Existe una gran cantidad de reactivos de biotinilación disponibles que explotan la amplia gama de posibles métodos de etiquetado. Debido a la fuerte afinidad entre la biotina y la estreptavidina, la purificación de proteínas biotiniladas ha sido un enfoque ampliamente utilizado para identificar interacciones proteína-proteína y eventos postraduccionales como la ubiquitilación [1] en biología molecular.
Métodos de etiquetado
Las proteínas pueden biotinilarse química o enzimáticamente. La biotinilación química utiliza diversas químicas de conjugación para producir una biotinilación inespecífica de aminas, carboxilatos, sulfhidrilos y carbohidratos (por ejemplo, el acoplamiento NHS da biotinilación de cualesquiera aminas primarias en la proteína). La biotinilación enzimática da como resultado la biotinilación de una lisina específica dentro de una determinada secuencia por una biotina ligasa bacteriana. [2] La mayoría de los reactivos de biotinilación química consisten en un grupo reactivo unido a través de un enlazador a la cadena lateral del ácido valérico de la biotina. Como el bolsillo de unión de biotina en avidina / estreptavidina está enterrado debajo de la superficie de la proteína, son deseables los reactivos de biotinilación que poseen un conector más largo, ya que permiten que la molécula de biotina, una vez que se ha unido a su objetivo, sea más accesible para unirse a avidina / estreptavidina. / Proteína Neutravidina. Este enlazador también puede mediar en la solubilidad de los reactivos de biotinilación; los enlazadores que incorporan poli (etilen) glicol (PEG) pueden hacer que los reactivos insolubles en agua sean solubles o aumentar la solubilidad de los reactivos de biotinilación que ya son solubles hasta cierto punto.
Biotinilación enzimática
A diferencia de los métodos de biotinilación química, la biotinilación enzimática permite que la biotina se una a exactamente un residuo presente en la proteína. Esta reacción de biotinilación también puede completarse, lo que significa que el producto se genera con alta uniformidad y se puede unir a la estreptavidina en una orientación definida, por ejemplo, para multímeros MHC . La biotinilación enzimática la realiza con mayor frecuencia la biotina holoenzima sintetasa de E. coli , también conocida como biotina ligasa (BirA, P06709 ). [3] [4]
La forma más común de dirigirse a una proteína de interés es fusionando la proteína en su extremo N-terminal, C-terminal o en un bucle interno con un péptido de 15 aminoácidos (GLNDIFEAQKIEWHE), denominado AviTag o péptido aceptor (AP). [5] Una vez marcada, la proteína se incuba con BirA permitiendo que la biotinilación tenga lugar en presencia de biotina y ATP. [5] La biotinilación enzimática se puede llevar a cabo in vitro, pero BirA también reacciona específicamente con su péptido diana dentro de las células de mamíferos y bacterias y en la superficie celular, mientras que otras proteínas celulares no se modifican. [6] [7] [8] La biotinilación enzimática también puede tener lugar in vivo, típicamente a través de la coexpresión de una proteína marcada con Avitag y BirA. [9]
El sustrato natural de BirA es la proteína transportadora de biotina carboxilo (BCCP). Antes de que se descubrieran etiquetas más pequeñas, era necesario fusionar una proteína con todo el BCCP para ser el objetivo. [10] Una proteína fusionada por BCCP puede ser reconocida por moléculas de biotina in vivo y unirse a ella. [11] Algunas otras etiquetas pequeñas se han utilizado antes de AviTag, pero AviTag es la más eficiente hasta ahora. [4]
Biotinilación de amina primaria
Los objetivos más comunes para modificar moléculas de proteína son los grupos de amina primaria que están presentes como épsilon-aminas de cadena lateral de lisina y α-aminas N-terminales. Los reactivos de biotinilación que reaccionan con amina se pueden dividir en dos grupos según la solubilidad en agua .
Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) tienen poca solubilidad en soluciones acuosas . Para reacciones en solución acuosa, primero deben disolverse en un solvente orgánico y luego diluirse en la mezcla de reacción acuosa . Los disolventes orgánicos más utilizados para este fin son el dimetilsulfóxido (DMSO) y la dimetilformamida (DMF), que son compatibles con la mayoría de las proteínas a bajas concentraciones. Debido a la hidrofobicidad de los ésteres de NHS, los reactivos de biotinilación de NHS también pueden difundirse a través de la membrana celular , lo que significa que biotinilan los componentes internos y externos de una célula .
Los ésteres de sulfo-NHS son más solubles en agua y deben disolverse en agua justo antes de su uso porque se hidrolizan fácilmente. La solubilidad en agua de los ésteres sulfo-NHS proviene de su grupo sulfonato en el anillo de N-hidroxisuccinimida y elimina la necesidad de disolver el reactivo en un solvente orgánico. Los ésteres sulfo-NHS de biotina también se pueden utilizar como reactivos de biotinilación de la superficie celular, ya que no penetran en la membrana celular .
Las reacciones químicas de los ésteres NHS y sulfo-NHS son esencialmente idénticas, ya que ambos reaccionan espontáneamente con las aminas para formar un enlace amida. Debido a que el objetivo del éster es una amina primaria desprotonada, la reacción se favorece en condiciones básicas (por encima de pH 7). La hidrólisis del éster NHS es una reacción competitiva importante y la velocidad de hidrólisis aumenta con el aumento del pH . Los ésteres NHS y sulfo-NHS tienen una vida media de varias horas a pH 7, pero solo unos pocos minutos a pH 9.
Hay cierta flexibilidad en las condiciones para conjugar ésteres de NHS con aminas primarias. Las temperaturas de incubación pueden oscilar entre 4 y 37 ° C, los valores de pH en el intervalo de reacción entre 7 y 9 y los tiempos de incubación varían entre unos pocos minutos y 12 horas. Se deben evitar los tampones que contienen aminas (como Tris o glicina ) porque compiten con la reacción.
Biotinilación de sulfhidrilo
Una alternativa a la biotinilación de amina primaria es marcar los grupos sulfhidrilo con biotina. Debido a que los grupos sulfhidrilo libres son menos frecuentes en la mayoría de las proteínas en comparación con las aminas primarias, la biotinilación de sulfhidrilo es útil cuando las aminas primarias se encuentran en el dominio o dominios reguladores de la proteína diana o cuando se requiere un nivel reducido de biotinilación. Los grupos reactivos con sulfhidrilo, tales como maleimidas , haloacetilo y disulfuros de piridilo, requieren grupos sulfhidrilo libres para la conjugación; Los enlaces disulfuro primero deben reducirse para liberar los grupos sulfhidrilo para la biotinilación. Si no hay grupos sulfhidrilo libres disponibles, las lisinas se pueden modificar con varios reactivos de tiolación (reactivo de Traut , SAT (PEG4), SATA y SATP), lo que da como resultado la adición de un sulfhidrilo libre. La biotinilación de sulfhidrilo se realiza a un pH ligeramente más bajo (6,5-7,5) que el marcado con ésteres de NHS.
Además de las proteínas completas, los péptidos biotinilados se pueden sintetizar introduciendo un residuo de cisteína (Cys) durante la síntesis en el extremo de la cadena de aminoácidos para obtener una biotinilación orientada y específica del sitio. Los nucleótidos también se pueden biotinilar mediante la incorporación de nucleótidos tiolados .
Biotinilación de carboxilo
Los grupos carboxilo se encuentran en los extremos C-terminales de las proteínas y en las cadenas laterales de aminoácidos de glutamato y aspartato. Los reactivos de biotinilación que se dirigen a grupos carboxilo no tienen un resto reactivo con carboxilo per se, sino que se basan en un reticulante de carbodiimida como EDC para unir la amina primaria en los reactivos de biotinilación al grupo carboxilo en la proteína diana.
La biotinilación en los grupos carboxilo se produce a un pH de 4,5 a 5,5. Para evitar la reactividad cruzada del reticulante con los constituyentes del tampón, los tampones no deben contener aminas primarias (por ejemplo, Tris , glicina ) o carboxilos (por ejemplo, acetato , citrato ); El búfer MES es una opción ideal.
Biotinilación de glicoproteínas
Las glicoproteínas se pueden biotinilar modificando los residuos de carbohidratos a aldehídos , que luego reaccionan con reactivos de biotinilación basados en hidrazina o alcoxiamina. El peryodato de sodio oxida los ácidos siálicos de las glicoproteínas a aldehídos para formar estos enlaces estables a pH 4-6.
Los anticuerpos policlonales están muy glicosilados y, dado que la glicosilación no interfiere con la actividad del anticuerpo, la biotinilación de los grupos glicosilo es una estrategia ideal para generar anticuerpos biotinilados.
Biotinilación de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se biotinilan fácilmente en el curso de la síntesis de oligonucleótidos mediante el método de la fosforamidita usando biotina fosforamidita comercial. [12] Tras la desprotección estándar, los conjugados obtenidos se pueden purificar mediante HPLC de intercambio aniónico o de fase inversa.
Biotinilación inespecífica
Los reactivos de biotinilación fotoactivables son ideales cuando no se dispone de aminas primarias, sulfhidrilos, carboxilos y carbohidratos para el etiquetado. Estos reactivos se basan en aril azidas, que se activan con la luz ultravioleta (UV;> 350 nm), que luego reaccionan en los enlaces CH y NH. Debido a que estos tipos de enlaces se producen independientemente del tipo de aminoácido, este tipo de biotinilación se denomina "no específica".
Los reactivos de biotinilación fotoactivables también se pueden usar para activar la biotinilación en momentos específicos en un experimento o durante ciertas condiciones de reacción, simplemente exponiendo la reacción a luz UV en el momento o condición específicos.
Propósito
Purificación
La etiqueta de biotina se puede usar en cromatografía de afinidad junto con una columna que tiene avidina (o estreptavidina o neutravidina ) unida a ella, que es el ligando natural de la biotina. Sin embargo, se necesitan condiciones severas (p. Ej., GuHCl 6 M a pH 1,5) para romper la interacción avidina / estreptavidina-biotina, que muy probablemente desnaturalizará la proteína que lleva la etiqueta de biotina. Si es necesario aislar la proteína marcada, es mejor marcar la proteína con iminobiotina . Este análogo de biotina proporciona una fuerte unión a avidina / estreptavidina a pH alcalino, pero la afinidad se reduce al bajar el pH. Por lo tanto, una proteína funcional etiquetada con iminobiotina puede liberarse de una columna de avidina / estreptavidina disminuyendo el pH (hasta aproximadamente pH 4). [13] [14]
Detección
Esta etiqueta también se puede utilizar en la detección de la proteína a través de anti-biotina anticuerpos o estrategias avidina / detección de estreptavidina marcada con la enzima tal como la prensa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante , fosfatasa alcalina ) o sondas fluorescentes . Esto puede ser útil en la localización por microscopía electrónica o fluorescente, [15] ensayos ELISA , ensayos ELISPOT , transferencias de Western y otros métodos inmunoanalíticos. La detección con estreptavidina monovalente puede evitar la agrupación o agregación del objetivo biotinilado. [dieciséis]
Otros usos
El enlace no covalente formado entre biotina y avidina o estreptavidina tiene una afinidad de unión mayor que la mayoría de los enlaces de antígeno y anticuerpo y se acerca a la fuerza de un enlace covalente . Esta unión muy estrecha hace que el etiquetado de proteínas con biotina sea una herramienta útil para aplicaciones como la cromatografía de afinidad utilizando avidina o estreptavidina inmovilizada para separar la proteína biotinilada de una mezcla de otras proteínas y productos bioquímicos. La proteína biotinilada, como la albúmina de suero bovino biotinilada (BSA), se usa en ensayos en fase sólida como revestimiento de la superficie del pocillo en placas de ensayo multipocillo. La biotinilación de glóbulos rojos se ha utilizado como un medio para determinar el volumen sanguíneo total sin el uso de radiomarcadores como el cromo 51, lo que permite realizar determinaciones de volumen en lactantes de bajo peso al nacer y mujeres embarazadas que de otro modo no podrían estar expuestas a las dosis requeridas de radiactividad. Además, la biotinilación de moléculas MHC para crear multímeros MHC se ha convertido en una herramienta útil para identificar y aislar poblaciones de células T específicas de antígeno . Más recientemente, se desarrolló la biotinilación de proteínas in vivo para estudiar las interacciones proteína-proteína y la proximidad en células vivas [17] [18] [19]
Determinando el grado de biotinilación
Las condiciones de reacción para la biotinilación se eligen de modo que la molécula diana (por ejemplo, un anticuerpo) se marque con suficientes moléculas de biotina para purificar o detectar la molécula, pero no tanto que la biotina interfiera con la función de la molécula.
Ensayo HABA
El ensayo de HABA (ácido 2- (4-hidroxiazobenceno) benzoico) se puede utilizar para determinar el grado de biotinilación. El colorante HABA se une a la avidina o la estreptavidina y produce una absorbancia característica. Cuando se introducen proteínas biotiniladas u otras moléculas, la biotina desplaza el tinte, lo que da como resultado un cambio en la absorbancia a 500 nm. Este cambio es directamente proporcional al nivel de biotina en la muestra. La desventaja del ensayo HABA es que utiliza grandes cantidades de muestra.
Desplazamiento en gel de estreptavidina
El alcance de la biotinilación también se puede medir mediante desplazamiento en gel de estreptavidina, ya que la estreptavidina permanece unida a la biotina durante la electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis en gel de poliacrilamida . La proporción de diana biotinilada se puede medir mediante el cambio en la intensidad de la banda de la diana con o sin exceso de estreptavidina, visto rápida y cuantitativamente para proteínas biotiniladas mediante tinción con azul brillante de Coomassie . [20]
Referencias
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