AFLP-PCR o simplemente AFLP es una herramienta basada en PCR que se utiliza en la investigación genética , la toma de huellas dactilares de ADN y en la práctica de la ingeniería genética . Desarrollado a principios de la década de 1990 por Keygene , [1] AFLP utiliza enzimas de restricción para digerir el ADN genómico , seguido de la ligadura de adaptadores a los extremos pegajosos de los fragmentos de restricción . A continuación, se selecciona un subconjunto de los fragmentos de restricción para amplificarlos. Esta selección se logra mediante el uso de imprimaciones.complementaria a la secuencia adaptadora, la secuencia del sitio de restricción y algunos nucleótidos dentro de los fragmentos del sitio de restricción (como se describe en detalle a continuación). Los fragmentos amplificados se separan y visualizan al desnaturalizarse en electroforesis en gel de agarosa , ya sea mediante metodologías de autorradiografía o fluorescencia , o mediante instrumentos de secuenciación capilar automatizados.
Aunque AFLP no debe usarse como un acrónimo, se denomina comúnmente "polimorfismo de longitud de fragmento amplificado". Sin embargo, los datos resultantes no se puntúan como polimorfismos de longitud, sino como polimorfismos de presencia-ausencia. [2]
AFLP-PCR es un método muy sensible para detectar polimorfismos en el ADN . La técnica fue descrita originalmente por Vos y Zabeau en 1993. [3] [2] En detalle, el procedimiento de esta técnica se divide en tres pasos:
- Digestión del ADN celular total con una o más enzimas de restricción y ligación de adaptadores específicos de medio sitio de restricción a todos los fragmentos de restricción.
- Amplificación selectiva de algunos de estos fragmentos con dos cebadores de PCR que tienen secuencias específicas de sitio de restricción y adaptador correspondientes.
- Separación electroforética de amplicones en una matriz de gel, seguida de visualización del patrón de bandas.
Aplicaciones
La tecnología AFLP tiene la capacidad de detectar varios polimorfismos en diferentes regiones genómicas simultáneamente. También es muy sensible y reproducible. Como resultado, AFLP se ha vuelto ampliamente utilizado para la identificación de variación genética en cepas o especies de plantas, hongos, animales y bacterias estrechamente relacionadas. La tecnología AFLP se ha utilizado en pruebas penales y de paternidad, también para determinar ligeras diferencias dentro de las poblaciones, y en estudios de vinculación para generar mapas para el análisis de locus de rasgos cuantitativos (QTL).
AFLP tiene muchas ventajas en comparación con otras tecnologías de marcadores, incluido el ADN polimórfico amplificado aleatoriamente ( RAPD ), el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y los microsatélites . AFLP no solo tiene una mayor reproducibilidad, resolución y sensibilidad a nivel del genoma completo en comparación con otras técnicas, [4] sino que también tiene la capacidad de amplificar entre 50 y 100 fragmentos a la vez. Además, no se necesita información de secuencia previa para la amplificación (Meudt & Clarke 2007). [5] Como resultado, AFLP se ha vuelto extremadamente beneficioso en el estudio de taxones que incluyen bacterias, hongos y plantas, donde aún se desconoce mucho sobre la composición genómica de varios organismos.
La tecnología AFLP está cubierta por patentes y solicitudes de patente de Keygene NV AFLP es una marca registrada de Keygene NV
Referencias
- ^ "Keygene.com" . Consultado el 10 de febrero de 2013 .
- ^ a b Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. (Noviembre de 1995). "AFLP: una nueva técnica para la toma de huellas de ADN" . Ácidos nucleicos Res . 23 (21): 4407-14. doi : 10.1093 / nar / 23.21.4407 . PMC 307397 . PMID 7501463 .
- ^ Zabeau, M y P. Vos. 1993. Amplificación selectiva de fragmentos de restricción: un método general para la toma de huellas dactilares de ADN. Oficina Europea de Patentes, publicación 0 534 858 A1, boletín 93/13.
- ^ Mueller UG, Wolfenbarger LL (octubre de 1999). "Genotipado y huellas dactilares de AFLP". Tendencias Ecol. Evol . 14 (10): 389–394. CiteSeerX 10.1.1.115.2957 . doi : 10.1016 / S0169-5347 (99) 01659-6 . PMID 10481200 .
- ^ Meudt HM, Clarke AC (marzo de 2007). “¿Práctica casi olvidada o última? Aplicaciones, análisis y avances de AFLP”. Tendencias Plant Sci . 12 (3): 106-17. doi : 10.1016 / j.tplants.2007.02.001 . PMID 17303467 .
enlaces externos
Software para analizar datos AFLP
- BioNumerics Una plataforma universal para administrar y analizar todos sus datos biológicos, incluido AFLP
- KeyGene Quantar Suite Software de puntuación de marcadores versátil
- SoftGenetics GeneMarker software de análisis de fragmentos
Freeware para analizar datos AFLP
- SourceForge Genographer Software gratuito para puntuación manual (aplicación Java)
- Puntuación automática de SourceForge RawGeno Free (entorno R CRAN, incluida una GUI fácil de usar)
Programas en línea para la simulación de AFLP-PCR
- ALFIE - BProcariotas o secuencias cargadas
- AFLP-PCR in silico para procariotas , algunos eucariotas o secuencias cargadas
- Enzimas para AFLP New England Biolabs
- Nota de tecnología AFLP en KeyGene
- Aplicaciones AFLP