RESOLFT

RESOLFT , un acrónimo de RE reversible S aturable O ptica L F luorescence T ransitions, denota un grupo de técnicas de microscopía de fluorescencia óptica de muy alta resolución. Utilizando ópticas de luz visible de campo lejano estándar, se puede obtener una resolución muy por debajo del límite de difracción hasta escalas moleculares.

Con las técnicas de microscopía convencionales , no es posible distinguir las características que se encuentran a distancias inferiores a aproximadamente la mitad de la longitud de onda utilizada (es decir, aproximadamente 200 nm para la luz visible ). Este límite de difracción se basa en la naturaleza ondulatoria de la luz . En los microscopios convencionales, el límite está determinado por la longitud de onda utilizada y la apertura numérica del sistema óptico. El concepto RESOLFT supera este límite al cambiar temporalmente las moléculas a un estado en el que no pueden enviar una señal (de fluorescencia) al iluminarse. Este concepto es diferente, por ejemplo, de la microscopía electrónica donde, en cambio, la longitud de onda utilizada es mucho menor.

Principio de funcionamiento

La microscopía RESOLFT es una microscopía óptica con una resolución muy alta que puede obtener imágenes de detalles en muestras que no se pueden obtener con microscopía convencional o confocal . Dentro de RESOLFT se generalizan los principios de microscopía STED ^{[1] [2]} y microscopía GSD . Las estructuras que normalmente están demasiado próximas entre sí para ser distinguidas se leen secuencialmente.

Dentro de este marco, se pueden explicar todos los métodos que operan sobre moléculas que tienen al menos dos estados distinguibles, donde es posible el cambio reversible entre los dos estados, y donde al menos una de tales transiciones puede inducirse ópticamente.

En la mayoría de los casos se utilizan marcadores fluorescentes, donde un estado (A) es brillante, es decir, genera una señal de fluorescencia, y el otro estado (B) es oscuro y no da señal. La luz puede inducir una transición entre ellos (por ejemplo, A → B, brillante a oscuro).

La muestra se ilumina de manera no homogénea, siendo la intensidad de iluminación en una posición muy pequeña (cero en condiciones ideales). Solo en este lugar las moléculas nunca están en el estado oscuro B (si A es el estado preexistente) y permanecen completamente en el estado brillante A. El área donde las moléculas están en su mayoría en el estado brillante se puede hacer muy pequeña (más pequeña que el límite de difracción convencional) aumentando la intensidad de la luz de transición (ver más abajo). Por lo tanto, se sabe que cualquier señal detectada proviene solo de moléculas en el área pequeña alrededor del mínimo de intensidad de iluminación. Se puede construir una imagen de alta resolución escaneando la muestra, es decir, cambiando el perfil de iluminación a través de la superficie. ^[3]

La transición de regreso de B a A puede ser espontánea o impulsada por luz de otra longitud de onda. Las moléculas tienen que ser intercambiables varias veces para estar presentes en el estado A o B en diferentes momentos durante el escaneo de la muestra. El método también funciona si se invierten los estados brillante y oscuro, entonces se obtiene una imagen negativa.

Resolución por debajo del límite de difracción

Principio RESOLFT: La muestra no está homogéneamente iluminada (línea roja). La intensidad se reduce en un área comparable al límite de resolución clásico, pero es (idealmente) cero en una sola posición. La intensidad umbral (línea azul) requerida para cambiar las moléculas al estado oscuro es solo una fracción de la intensidad máxima aplicada, por lo que solo las moléculas muy cercanas a la posición de intensidad mínima pueden estar en el estado brillante. El área verde en el cuadro de la derecha ilustra el tamaño del área donde las moléculas pueden generar una señal.

En RESOLFT, el área donde residen las moléculas en el estado A (estado brillante) puede hacerse arbitrariamente pequeña a pesar del límite de difracción.

• Hay que iluminar la muestra de forma no homogénea para que se cree un punto de intensidad cero aislado. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante interferencias.
• A bajas intensidades (más bajas que la línea azul en la imagen), la mayoría de las moléculas marcadoras están en el estado brillante, si la intensidad es superior, la mayoría de los marcadores están en el estado oscuro.

Tras una iluminación débil, vemos que el área donde las moléculas permanecen en el estado A sigue siendo bastante grande porque la iluminación es tan baja que la mayoría de las moléculas residen en el estado A. No es necesario alterar la forma del perfil de iluminación. El aumento del brillo de la iluminación ya da como resultado un área más pequeña donde la intensidad está por debajo de la cantidad para un cambio eficiente al estado oscuro. En consecuencia, también disminuye el área donde las moléculas pueden residir en el estado A. La señal (de fluorescencia) durante una lectura siguiente se origina en un punto muy pequeño y se pueden obtener imágenes muy nítidas.

En el concepto RESOLFT, la resolución se puede aproximar por , por lo que es la intensidad característica requerida para saturar la transición (la mitad de las moléculas permanecen en el estado A y la otra mitad en el estado B), y denota la intensidad aplicada. Si los mínimos se obtienen enfocando ópticas con una apertura numérica , la distancia mínima a la que se pueden discernir dos objetos idénticos es lo que puede considerarse una extensión de la ecuación de Abbe . La naturaleza de difracción ilimitada de la familia de conceptos RESOLFT se refleja en el hecho de que la distancia mínima resoluble se puede reducir continuamente aumentando${\displaystyle \Delta d\simeq {\frac {\lambda }{\pi n{\sqrt {\frac {I}{Isat}}}}}}$${\displaystyle I_{sat}}$${\displaystyle I}$${\displaystyle {\mbox{NA}}=n\sin \alpha }$${\displaystyle \Delta d={\frac {\lambda }{2n\cdot \sin \alpha \cdot {\sqrt {1+{\frac {I}{Isat}}}}}}}$${\displaystyle \Delta d}$${\displaystyle \varsigma ={\frac {I}{Isat}}}$. Por lo tanto, la búsqueda de una resolución a nanoescala se reduce a maximizar esta cantidad. Esto es posible aumentando o disminuyendo .${\displaystyle I}$${\displaystyle I_{sat}}$

Variantes

Se utilizan diferentes procesos al cambiar los estados moleculares. Sin embargo, todos tienen en común que se utilizan al menos dos estados distinguibles. Normalmente, la propiedad de fluorescencia utilizada marca la distinción de los estados, sin embargo, esto no es esencial, ya que también se podrían aprovechar las propiedades de absorción o dispersión. ^[4]

Microscopía STED

(Artículo principal microscopía STED )

Dentro de la microscopía STED (microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas) ^{[1] [2],} una molécula de colorante fluorescente es impulsada entre su estado fundamental electrónico y su estado excitado mientras envía fotones de fluorescencia. Este es el modo de funcionamiento estándar en microscopía de fluorescencia y representa el estado A. En el estado B, el tinte se mantiene permanentemente en su estado básico electrónico a través de la emisión estimulada . Si el tinte puede emitir fluorescencia en el estado A y no en el estado B, se aplica el concepto RESOLFT.

Microscopía GSD

(Artículo principal microscopía GSD )

La microscopía GSD (microscopía de agotamiento del estado fundamental) también utiliza marcadores fluorescentes. En el estado A, la molécula se puede conducir libremente entre el suelo y el primer estado excitado y se puede enviar fluorescencia. En el estado oscuro B, el estado fundamental de la molécula se despobla, se produce una transición a un estado excitado de larga duración a partir del cual no se emite fluorescencia. Mientras la molécula esté en el estado oscuro, no está disponible para el ciclo entre el suelo y el estado excitado, por lo que la fluorescencia se apaga.

SPEM y SSIM

SPEM (microscopía de excitación de patrón saturado) ^[5] y SSIM (microscopía de iluminación estructurada saturada) ^[6] están explotando el concepto RESOLFT utilizando excitación saturada para producir imágenes "negativas", es decir, la fluorescencia se produce en todas partes excepto en una región muy pequeña alrededor de la geometría. foco del microscopio. También se utilizan patrones no puntuales para la iluminación. La reconstrucción matemática de imágenes es necesaria para volver a obtener imágenes positivas.

RESOLFT con proteínas intercambiables

Algunas proteínas fluorescentes se pueden encender y apagar con luz de una longitud de onda adecuada. Se pueden utilizar en un microscopio tipo RESOLFT. ^[7] Durante la iluminación con luz, estas proteínas cambian su conformación. En el proceso, ganan o pierden su capacidad de emitir fluorescencia. El estado fluorescente corresponde al estado A, el no fluorescente al estado B y el concepto RESOLFT se aplica nuevamente. La transición reversible (por ejemplo, de B de nuevo a A) se produce de forma espontánea o de nuevo impulsada por la luz. La inducción de cambios conformacionales en las proteínas ya se puede lograr a intensidades de luz de conmutación mucho más bajas en comparación con la emisión estimulada o el agotamiento del estado fundamental (algo de W / cm²). En combinación con microscopía 4PiSe han tomado imágenes con resolución isotrópica por debajo de 40 nm de células vivas a niveles bajos de luz. ^[8]

RESOLFT con tintes orgánicos intercambiables

Al igual que con las proteínas, también algunos tintes orgánicos pueden cambiar su estructura al iluminarse. ^{[9] [10]} La capacidad de producir fluorescencia de tales tintes orgánicos se puede activar y desactivar a través de la luz visible. De nuevo, las intensidades de luz aplicadas pueden ser bastante bajas (unos 100 W / cm²).

Referencias

1. Stefan W. Hell y Jan Wichmann (1994). "Rompiendo el límite de resolución de difracción por emisión estimulada: microscopía de fluorescencia de reducción de emisión estimulada" . Letras de óptica . 19 (11): 780-2. Código bibliográfico : 1994OptL ... 19..780H . doi : 10.1364 / OL.19.000780 . PMID  19844443 .
2. Thomas A. Klar; Stefan W. Hell (1999). "Resolución de subdifracción en microscopía de fluorescencia de campo lejano" . Letras de óptica . 24 (14): 954–956. Código Bibliográfico : 1999OptL ... 24..954K . doi : 10.1364 / OL.24.000954 . PMID 18073907 . 
3. Véase también Microscopía de barrido láser confocal .
4. Stefan W. Hell (2004). "Estrategia para escritura y captura de imágenes ópticas de campo lejano sin límite de difracción". Physics Letters A . 326 (1–2): 140–145. Código Bibliográfico : 2004PhLA..326..140H . doi : 10.1016 / j.physleta.2004.03.082 .
5. Rainer Heintzmann; Thomas M. Jovin; Christoph Cremer (2002). "Microscopía de excitación con patrón saturado un concepto para la mejora de la resolución óptica" . Revista de la Sociedad Americana de Óptica A . 19 (8): 1599–2109. Código de Bibliografía : 2002JOSAA..19.1599H . doi : 10.1364 / JOSAA.19.001599 . hdl : 11858 / 00-001M-0000-0029-2C24-9 . PMID 12152701 . 
6. Alfombrillas GL Gustafsson (2005). "Microscopía de iluminación estructurada no lineal: imágenes de fluorescencia de campo amplio con resolución teóricamente ilimitada" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (37): 13081–6. Código bibliográfico : 2005PNAS..10213081G . doi : 10.1073 / pnas.0406877102 . PMC 1201569 . PMID 16141335 .  
7. Michael Hofmann; Christian Eggeling; Stefan Jakobs; Stefan W. Hell (2005). "Rompiendo la barrera de difracción en microscopía de fluorescencia a bajas intensidades de luz mediante el uso de proteínas fotoconmutables reversiblemente" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (49): 17565–9. Código bibliográfico : 2005PNAS..10217565H . doi : 10.1073 / pnas.0506010102 . PMC 1308899 . PMID 16314572 .  
8. Ulrike Böhm; Stefan W. Hell; Roman Schmidt (2016). "Nanoscopia 4Pi-RESOLFT" . Comunicaciones de la naturaleza . 7 (10504): 1–8. Código Bibliográfico : 2016NatCo ... 710504B . doi : 10.1038 / ncomms10504 . PMC 4740410 . PMID 26833381 .  
9. Mariano Bossi; Jonas Fölling; Marcus Dyba; Volker Westphal; Stefan W. Hell (2006). "Rompiendo la barrera de resolución de difracción en microscopía de campo lejano por biestabilidad óptica molecular" . Nueva Revista de Física . 8 (11): 275. Bibcode : 2006NJPh .... 8..275B . doi : 10.1088 / 1367-2630 / 8/11/275 .
10. Jiwoong Kwon; Jihee Hwang; Parque Jaewan; Gi Rim Han; Kyu Young Han; Seong Keun Kim (2015). "Nanoscopia RESOLFT con fluoróforos orgánicos fotoconmutables" . Informes científicos . 5 : 17804. Bibcode : 2015NatSR ... 517804K . doi : 10.1038 / srep17804 . PMC 4671063 . PMID 26639557 .