La microscopía de agotamiento del estado fundamental ( microscopía GSD ) es una implementación del concepto RESOLFT . El método fue propuesto en 1995 [1] y demostrado experimentalmente en 2007. [2] Es el segundo concepto para superar la barrera de difracción en microscopía óptica de campo lejano publicado por Stefan Hell . Utilizando centros de vacantes de nitrógeno en diamantes, se logró una resolución de hasta 7,8 nm en 2009. [3] Esto está muy por debajo del límite de difracción (~ 200 nm).
Principio
En microscopía GSD, se utilizan marcadores fluorescentes. En una condición, el marcador se puede excitar libremente desde el estado fundamental y regresa espontáneamente mediante la emisión de un fotón de fluorescencia. Sin embargo, si se aplica adicionalmente luz de longitud de onda apropiada, el tinte puede excitarse hasta un estado oscuro de larga duración, es decir, un estado en el que no se produce fluorescencia. Mientras la molécula se encuentre en el estado oscuro de larga duración (por ejemplo, un estado triplete ), no puede excitarse desde el estado fundamental. El cambio entre estos dos estados (brillante y oscuro) mediante la aplicación de luz cumple todas las condiciones previas para el concepto RESOLFT y las imágenes de escala de sublongitud de onda y, por lo tanto, se pueden obtener imágenes con una resolución muy alta. Para una implementación exitosa, la microscopía GSD requiere fluoróforos especiales con alto rendimiento de triplete, [4] o eliminación de oxígeno mediante el uso de varios medios de montaje como Mowiol o Vectashield. [2]
La implementación en un microscopio es muy similar a la microscopía de agotamiento de emisión estimulada , sin embargo, puede operar con una sola longitud de onda para excitación y agotamiento. Usando un punto focal similar a un anillo apropiado para la luz que cambia las moléculas al estado oscuro, la fluorescencia se puede apagar en la parte exterior del punto focal. Por lo tanto, la fluorescencia solo sigue teniendo lugar en el centro del punto focal del microscopio y aumenta la resolución espacial.
Referencias
- ^ Stefan W. Hell M. Kroug (1995). "Microscopía de fluorescencia de agotamiento del estado fundamental: un concepto para romper el límite de resolución de difracción". Física Aplicada B: Láseres y Óptica . 60 (5): 495–497. Código bibliográfico : 1995ApPhB..60..495H . doi : 10.1007 / BF01081333 .
- ^ a b Stefan Bretschneider; Christian Eggeling; Stefan W. Hell (2007). "Rompiendo la barrera de difracción en microscopía de fluorescencia por estantería óptica" . Cartas de revisión física . 98 (5): 218103. Código Bibliográfico : 2007PhRvL..98u8103B . doi : 10.1103 / PhysRevLett.98.218103 . hdl : 11858 / 00-001M-0000-0012-E125-B . PMID 17677813 .
- ^ Eva Rittweger; Dominik Wildanger; Stefan W. Hell (2009). "Nanoscopia de fluorescencia de campo lejano de centros de color de diamante por agotamiento del estado fundamental" (PDF) . EPL . 86 (1): 14001. Código Bibliográfico : 2009EL ..... 8614001R . doi : 10.1209 / 0295-5075 / 86/14001 .
- ^ Andriy Chmyrov; Jutta Arden-Jacob; Alexander Zilles; Karl-Heinz Drexhage; Jerker Widengren (2008). "Caracterización de nuevos marcadores fluorescentes para microscopía de ultra alta resolución". Ciencias fotoquímicas y fotobiológicas . 7 (11): 1378-1385. doi : 10.1039 / B810991P . PMID 18958325 .