La microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas ( STED ) es una de las técnicas que componen la microscopía de súper resolución . Crea imágenes de súper resolución mediante la desactivación selectiva de fluoróforos , minimizando el área de iluminación en el punto focal y mejorando así la resolución alcanzable para un sistema dado. [1] Fue desarrollado por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, [2] y fue demostrado experimentalmente por primera vez por Hell y Thomas Klar en 1999. [3] Hell recibió el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo. En 1986, VA Okhonin[4] (Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de la URSS, Rama Siberiana, Krasnoyarsk) había patentado la idea STED. [5] Esta patente era, quizás, desconocida para Hell y Wichmann en 1994.
La microscopía STED es uno de varios tipos de técnicas de microscopía de súper resolución que se han desarrollado recientemente para evitar el límite de difracción de la microscopía óptica para aumentar la resolución. STED es una técnica funcional determinista que aprovecha la respuesta no lineal de los fluoróforos comúnmente utilizados para etiquetar muestras biológicas con el fin de lograr una mejora en la resolución, es decir, STED permite tomar imágenes con resoluciones por debajo del límite de difracción. Esto difiere de las técnicas funcionales estocásticas como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), ya que estos métodos utilizan modelos matemáticos para reconstruir un límite de sub difracción a partir de muchos conjuntos de imágenes limitadas por difracción.
Fondo
En la microscopía tradicional, la resolución que se puede obtener está limitada por la difracción de la luz . Ernst Abbe desarrolló una ecuación para describir este límite. La ecuación es:
donde D es el límite de difracción, λ es la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica , o el índice de refracción del medio multiplicado por el seno del ángulo de incidencia. n describe el índice de refracción de la muestra, α mide el semángulo sólido desde el que un objetivo capta la luz, λ es la longitud de onda de la luz utilizada para excitar la muestra y NA es la apertura numérica. Para obtener una alta resolución (es decir, valores pequeños de d), las longitudes de onda cortas y los valores altos de NA (NA = n sinα) son óptimos. [6] Este límite de difracción es el estándar por el cual se miden todos los métodos de superresolución. Debido a que STED desactiva selectivamente la fluorescencia, puede lograr una resolución mejor que la microscopía confocal tradicional. La fluorescencia normal se produce al excitar un electrón del estado fundamental a un estado electrónico excitado de un nivel de energía fundamental diferente (S0 va a S1) que, después de relajarse de nuevo al estado fundamental (de S1), emite un fotón al pasar de S1 a un nivel de energía vibratoria en S0. STED interrumpe este proceso antes de que se libere el fotón. El electrón excitado se ve obligado a relajarse a un estado de vibración más alto del que entraría la transición de fluorescencia, lo que hace que el fotón que se libera se desplace al rojo como se muestra en la imagen de la derecha. [7] Debido a que el electrón pasa a un estado vibratorio más alto, la diferencia de energía de los dos estados es menor que la diferencia de fluorescencia normal. Esta disminución de energía aumenta la longitud de onda y hace que el fotón se desplace más hacia el extremo rojo del espectro. Este cambio diferencia los dos tipos de fotones y permite ignorar el fotón estimulado.
Para forzar a que ocurra esta emisión alternativa, un fotón incidente debe golpear el fluoróforo. Esta necesidad de ser golpeado por un fotón incidente tiene dos implicaciones para STED. En primer lugar, el número de fotones incidentes impacta directamente en la eficiencia de esta emisión y, en segundo lugar, con un número suficientemente grande de fotones, la fluorescencia puede suprimirse por completo. [8] Para lograr la gran cantidad de fotones incidentes necesarios para suprimir la fluorescencia, el láser utilizado para generar los fotones debe ser de alta intensidad. Desafortunadamente, este láser de alta intensidad puede conducir al problema del fotoblanqueo del fluoróforo. El fotoblanqueo es el nombre que se le da a la destrucción de los fluoróforos por la luz de alta intensidad.
Proceso
STED funciona agotando la fluorescencia en regiones específicas de la muestra mientras deja un punto focal central activo para emitir fluorescencia. Esta área focal se puede diseñar alterando las propiedades del plano de la pupila de la lente del objetivo. [9] [10] [11] El primer ejemplo más común de estos elementos ópticos difractivos, o DOE, es una forma de toro utilizada en el confinamiento lateral bidimensional que se muestra a continuación. La zona roja se agota, mientras que la mancha verde se deja activa. Este DOE se genera mediante una polarización circular del láser de agotamiento, combinado con un vórtice óptico . La resolución lateral de este DOE suele estar entre 30 y 80 nm. Sin embargo, se han informado valores de hasta 2,4 nm. [12] Utilizando diferentes DOE, se ha demostrado una resolución axial del orden de 100 nm. [13] Una ecuación de Abbe modificada describe esta resolución de sub difracción como:
Dónde es el índice de refracción del medio,es la intensidad intracavitaria yes la intensidad de saturación . Dónde es el factor de saturación que expresa la relación entre la intensidad STED aplicada (máxima) y la intensidad de saturación, . [6] [14]
Para optimizar la eficacia de STED, la interferencia destructiva en el centro del punto focal debe ser lo más perfecta posible. Eso impone ciertas limitaciones a la óptica que se puede utilizar.
Tintes
Al principio del desarrollo de STED, la cantidad de tintes que se podían usar en el proceso era muy limitada. La rodamina B fue nombrada en la primera descripción teórica de STED. [2] Como resultado, los primeros tintes utilizados fueron emisores de láser en el espectro rojo. Para permitir el análisis STED de sistemas biológicos, los tintes y las fuentes de láser deben adaptarse al sistema. Este deseo de un mejor análisis de estos sistemas ha llevado a STED de células vivas y STED multicolor, pero también ha exigido tintes y sistemas de excitación cada vez más avanzados para adaptarse a la mayor funcionalidad. [7]
Uno de esos avances fue el desarrollo de células inmunomarcadas. Estas células son tintes fluorescentes STED unidos a anticuerpos a través de enlaces amida. El primer uso de esta técnica acopló MR-121SE, un tinte rojo, con un anticuerpo secundario anti-ratón. [8] Desde esa primera aplicación, esta técnica se ha aplicado a una gama mucho más amplia de tintes, incluidos los de emisión verde, Atto 532, [15] [16] [17] y de emisión amarilla, Atto 590, [18] así como otros tintes emisores de rojo. Además, Atto 647N se utilizó por primera vez con este método para producir STED de dos colores. [19]
Aplicaciones
Durante los últimos años, STED se ha desarrollado desde una técnica compleja y altamente específica hasta un método de fluorescencia general. Como resultado, se han desarrollado varios métodos para ampliar la utilidad de STED y permitir que se proporcione más información.
Análisis estructural
Desde el inicio del proceso, STED ha permitido que la microscopía de fluorescencia realice tareas que solo habían sido posibles con la microscopía electrónica. Como ejemplo, se utilizó STED para elucidar el análisis de la estructura de la proteína a nivel de suborganelos. La prueba común de este nivel de estudio es la observación de filamentos citoesqueléticos. Además, los neurofilamentos , la actina y la tubulina se utilizan a menudo para comparar el poder de resolución de los microscopios STED y confocal. [20] [21] [22]
Usando STED, se logró una resolución lateral de 70 - 90 nm al examinar SNAP25 , una proteína humana que regula la fusión de membranas. Esta observación ha demostrado que SNAP25 forma grupos independientemente de la funcionalidad del motivo SNARE y se une a la sintaxina agrupada. [23] [24] Los estudios de orgánulos complejos, como las mitocondrias, también se benefician de la microscopía STED para el análisis estructural. Usando microscopios STED hechos a medida con una resolución lateral de menos de 50 nm, se encontró que las proteínas mitocondriales Tom20 , VDAC1 y COX2 se distribuían como grupos a nanoescala. [25] [26] Otro estudio utilizó una microscopía STED casera y un tinte fluorescente de unión al ADN , midieron las longitudes de los fragmentos de ADN con mucha más precisión que la medición convencional con microscopía confocal . [27]
Métodos correlativos
Debido a su función, la microscopía STED a menudo se puede utilizar con otros métodos de alta resolución. La resolución de la microscopía de fuerza tanto electrónica como atómica es incluso mejor que la resolución STED, pero al combinar la fuerza atómica con STED, Shima et al. pudieron visualizar el citoesqueleto de actina de las células de cáncer de ovario humano mientras observaban cambios en la rigidez celular. [28]
Multicolor
El STED multicolor se desarrolló en respuesta a un problema creciente en el uso de STED para estudiar la dependencia entre la estructura y la función de las proteínas. Para estudiar este tipo de sistema complejo, se deben utilizar al menos dos fluoróforos separados. Usando dos tintes fluorescentes y pares de haces, es posible obtener imágenes colocalizadas de grupos de proteínas sinápticas y mitocondriales con una resolución de hasta 5 nm [18]. También se ha utilizado STED multicolor para mostrar que diferentes poblaciones de proteínas de vesículas sinápticas no se mezclan de botones sinápticos de escape. [29] [30] Al utilizar STED de dos colores con imágenes de vida útil múltiple, es posible utilizar STED de tres canales.
Live-Cell
Al principio, se pensó que STED era una técnica útil para trabajar con células vivas. [13] Desafortunadamente, la única forma de estudiar las células era etiquetar la membrana plasmática con tintes orgánicos. [29] La combinación de STED con espectroscopía de correlación de fluorescencia mostró que los complejos moleculares mediados por el colesterol atrapan esfingolípidos , pero solo de manera transitoria. [31] Sin embargo, solo las proteínas fluorescentes proporcionan la capacidad de visualizar cualquier orgánulo o proteína en una célula viva. Se demostró que este método funciona a una resolución lateral de 50 nm en células de mamífero que expresan citrina-tubulina. [32] [33] Además de detectar estructuras en células de mamíferos, STED ha permitido la visualización de agrupaciones de proteínas PIN etiquetadas con YFP en la membrana plasmática de las células vegetales. [34]
Recientemente, se realizó STED de células vivas multicolor utilizando un láser rojo lejano pulsado y expresión de etiqueta CLIPf y etiqueta SNAPf. [35]
STED a velocidades de video y más
La superresolución requiere píxeles pequeños, lo que significa más espacios para adquirir en una muestra determinada, lo que conduce a un tiempo de adquisición más largo. Sin embargo, el tamaño del punto focal depende de la intensidad del láser que se utiliza para el agotamiento. Como resultado, este tamaño de punto se puede ajustar, cambiando el tamaño y la velocidad de la imagen. Entonces se puede llegar a un compromiso entre estos dos factores para cada tarea de imagen específica. Se han registrado velocidades de 80 fotogramas por segundo, con puntos focales de alrededor de 60 nm. [1] [36] Se pueden alcanzar hasta 200 fotogramas por segundo para campos de visión pequeños. [37]
Problemas
El fotoblanqueo puede ocurrir por excitación a un estado de excitación aún más alto, o por excitación en el estado de triplete. Para evitar la excitación de un electrón excitado a otro estado de excitación superior, la energía del fotón necesaria para activar la emisión alternativa no debe superponerse a la energía de la excitación de un estado excitado a otro. [38] Esto asegurará que cada fotón láser que entre en contacto con los fluoróforos provoque una emisión estimulada y no provoque que el electrón se excite a otro estado de mayor energía. Los estados de triplete tienen una vida mucho más larga que los estados de singlete, y para evitar que los estados de triplete se exciten, el tiempo entre pulsos de láser debe ser lo suficientemente largo para permitir que el electrón se relaje mediante otro método de extinción, o se debe agregar un compuesto químico para apagar el triplete Expresar. [20] [39] [40]
Ver también
- Microscopia confocal
- Fluorescencia
- Microscopio de fluorescencia
- Microscopía confocal de barrido láser
- Microscopio optico
- Microscopía de localización fotoactivada
- Microscopía de reconstrucción óptica estocástica
- Microscopía de súper resolución
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enlaces externos
- Descripción general en el Departamento de Nanobiofotónica del Instituto Max Planck de Química Biofísica .
- Breve resumen de las ecuaciones de RESOLFT desarrolladas por Stefan Hell .
- Conferencia de Stefan Hell: Superresolución: descripción general y microscopía de agotamiento de emisiones estimulado (STED)
- Microscopía óptica: una revolución contemporánea en curso (Revisión introductoria)