El represor es una red reguladora genética que consta de al menos un ciclo de retroalimentación con al menos tres genes, cada uno de los cuales expresa una proteína que reprime el siguiente gen del ciclo. [1] En la investigación biológica, se han utilizado represores para construir modelos celulares y comprender la función celular. Hay represores tanto artificiales como naturales. Recientemente, se ha estudiado el circuito del gen del reloj represor de origen natural en Arabidopsis thaliana ( A. thaliana ) y sistemas de mamíferos.
Represiladores Artificiales
Los represores artificiales fueron diseñados por primera vez por Michael Elowitz y Stanislas Leibler en 2000, [2] complementando otros proyectos de investigación que estudian sistemas simples de componentes y funciones celulares. Para comprender y modelar el diseño y los mecanismos celulares que confieren la función de una célula, Elowitz y Leibler crearon una red artificial que consta de un bucle con tres represores transcripcionales . Esta red fue diseñada desde cero para exhibir una oscilación estable que actúa como un sistema de oscilador eléctrico con períodos de tiempo fijos. La red se implementó en Escherichia coli ( E. coli) mediante transferencia de ADN recombinante. Luego se verificó que las colonias manipuladas efectivamente exhibían el comportamiento oscilatorio deseado.
El represor consta de tres genes conectados en un bucle de retroalimentación , de modo que cada gen reprime el siguiente gen en el bucle y es reprimido por el gen anterior. En la inserción sintética en E. Coli , se usó proteína verde fluorescente (GFP) como informadora para que se pudiera observar el comportamiento de la red usando microscopía de fluorescencia .
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/4/40/Repressilator_GRN.png)
El diseño del represor se guió por principios biológicos y de circuito con modelos de análisis discretos y estocásticos . Se utilizaron seis ecuaciones diferenciales para modelar la cinética del sistema represor basado en las concentraciones de proteína y ARNm , así como parámetros apropiados y valores de coeficiente de Hill . En el estudio, Elowitz y Leibler generaron figuras que muestran oscilaciones de proteínas represoras, utilizando valores de parámetros típicos y de integración, así como una versión estocástica del modelo represor utilizando parámetros similares. Estos modelos se analizaron para determinar los valores de varias tasas que producirían una oscilación sostenida. Se encontró que estas oscilaciones fueron favorecidas por promotores acoplados a sitios de unión de ribosomas eficientes , represores transcripcionales cooperativos y tasas de desintegración de proteínas y ARNm comparables.
Este análisis motivó dos características de diseño que se introdujeron en los genes. En primer lugar, las regiones promotoras se reemplazaron con un promotor híbrido más eficaz que combinaba el promotor PL (λ PL) del fago lambda de E. coli con las secuencias del operador del represor lac ( Lacl ) y del represor Tet ( TetR ). En segundo lugar, para reducir la disparidad entre la vida útil de las proteínas represoras y los mRNA, se añadió una etiqueta carboxi terminal basada en la secuencia de ssrA-RNA en el extremo 3 'de cada gen represor. Esta etiqueta es reconocida por proteasas que se dirigen a la proteína para su degradación. El diseño se implementó utilizando un plásmido de baja copia que codifica el represor y un indicador de mayor copia, que se utilizaron para transformar un cultivo de E. coli .
Represiladores que ocurren naturalmente
Plantas
Los circuitos circadianos en las plantas presentan un circuito de retroalimentación reguladora transcripcional llamado represor. En el bucle del oscilador central (delineado en gris) en A. thaliana , la luz es detectada primero por dos criptocromos y cinco fitocromos . Dos factores de transcripción, Circadian Clock Associated 1 (CCA1) e Late Elongated Hypocotyl (LHY), reprimen genes asociados con la expresión vespertina como Timing of CAB expression 1 ( TOC1 ) y activan genes asociados con la expresión matutina uniéndose a sus promotores. TOC1 , un gen vespertino, regula positivamente CCA1 y LHY a través de un mecanismo desconocido. [3] El factor de transcripción en fase nocturna CCA1 Hiking Expedition (CHE) y el dominio C de histona desmetilasa jumonji 5 (JMJD5) reprimen directamente CCA1 . Se ha descubierto que otros componentes se expresan a lo largo del día e inhiben o activan directa o indirectamente un elemento consecuente en el circuito circadiano, creando así una red compleja, robusta y flexible de circuitos de retroalimentación. [3]
Expresión de la fase matutina
El bucle de expresión de la fase matutina se refiere a los genes y proteínas que regulan los ritmos durante el día en A. thaliana . Los dos genes principales son LHY y CCA1, que codifican los factores de transcripción LHY y CCA1. [4] Estas proteínas forman heterodímeros que ingresan al núcleo y se unen al promotor del gen TOC1 , reprimiendo la producción de la proteína TOC1. Cuando se expresa la proteína TOC1, sirve para regular LHY y CCA1 mediante la inhibición de su transcripción. Esto fue apoyado más tarde en 2012 por la Dra. Alexandra Pokhilo, quien utilizó análisis computacionales para demostrar que TOC1 cumplía esta función como inhibidor de la expresión de LHY y CCA1 . [5] El bucle matutino sirve para inhibir el alargamiento del hipocótilo , en contraste con el bucle de la fase vespertina que promueve el alargamiento del hipocótilo. El ciclo de la fase matutina ha demostrado ser incapaz de soportar la oscilación circadiana cuando los genes de expresión de la fase vespertina han sido mutados, [5] sugiriendo la interdependencia de cada componente en este represor natural.
Expresión de la fase vespertina
Early Flowering 3 ( ELF3 ), Early Flowering 4 ( ELF4 ) y Phytoclock1 ( LUX ) son los elementos clave en la expresión génica del reloj en fase vespertina en A. thaliana. Forman el complejo vespertino, en el que LUX se une a los promotores del factor de interacción de fitocromo 4 ( PIF4 ) y el factor de interacción de fitocromo 5 ( PIF5 ) y los inhibe. [3] Como resultado, el alargamiento del hipocótilo se reprime en las primeras horas de la noche. Cuando la inhibición se alivia a altas horas de la noche, el hipocótilo se alarga. La floración del fotoperíodo está controlada por el gen de producción Gigantea ( GI ). GI se activa por la noche y activa la expresión de Constans ( CO ), que activa la expresión de Floración Locus T ( FT ). La FT provoca entonces la floración en días largos. [3]
Mamíferos
Los mamíferos desarrollaron un mecanismo de sincronización endógeno para coordinar tanto la fisiología como el comportamiento en el período de 24 horas. [6] En 2016, los investigadores identificaron una secuencia de tres inhibiciones posteriores dentro de este mecanismo que identificaron como un represor, que ahora se cree que sirve como un elemento central importante de esta red circadiana. La necesidad de este sistema se estableció a través de una serie de eliminaciones genéticas entre el criptocromo ( Cry ), el período ( Per ) y el Rev-erb , genes del reloj central de los mamíferos cuyos knockouts conducen a la arritmicidad. [6] El modelo que generaron estos investigadores incluye Bmal1 como un impulsor de la transcripción mediada por E-box, Per2 y Cry1 como represores de E-box temprano y tardío , respectivamente, así como el regulador D-box Dbp y el receptor nuclear Rev- erb-α . Las inhibiciones secuenciales de Rev-erb , Per y Cry1 pueden generar oscilaciones sostenidas, y al bloquear todos los demás componentes, excepto este represor, las oscilaciones persistieron con amplitudes y períodos similares. [6] Todas las redes oscilantes parecen involucrar cualquier combinación de estos tres genes centrales, como se demuestra en varios esquemas publicados por los investigadores.
Trabajo reciente
El modelo represor se ha utilizado para modelar y estudiar otras vías y sistemas biológicos. Desde entonces, se ha realizado un trabajo extenso sobre las capacidades de modelado del represor. En 2003, la representación y validación de modelos biológicos por parte del represor, al ser un modelo con muchas variables, se realizó utilizando el sistema Simpathica, que verificó que el modelo efectivamente oscila con todas sus complejidades.
Como se indica en el trabajo original de Elowitz y Leibler, el objetivo final de la investigación sobre represores es construir un reloj circadiano artificial que refleje su contraparte natural y endógena. Esto implicaría desarrollar un reloj artificial con reducción de ruido y compensación de temperatura para comprender mejor los ritmos circadianos que se pueden encontrar en todos los ámbitos de la vida. [7] La alteración de los ritmos circadianos puede conducir a la pérdida de ritmo en los procesos metabólicos y transcripcionales , e incluso acelerar la aparición de ciertas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer . [8] En 2017, se crearon en un laboratorio osciladores que generaban ritmos circadianos y no estaban muy influenciados por la temperatura. [6]
Patológicamente , el modelo represor puede usarse para modelar el crecimiento celular y las anomalías que pueden surgir, como las presentes en las células cancerosas . [9] Al hacerlo, se pueden desarrollar nuevos tratamientos basados en la actividad circadiana de las células cancerosas. Además, en 2016, un equipo de investigación mejoró el diseño anterior del represor. Después del análisis de ruido (procesamiento de señales) , los autores trasladaron la construcción informadora de GFP al plásmido represor y eliminaron las etiquetas de degradación de ssrA de cada proteína represora. Esto amplió el período y mejoró la regularidad de las oscilaciones del represor. [10]
En 2019, un estudio impulsó el modelo de Elowitz y Leibler al mejorar el sistema represor al lograr un modelo con un estado estable único y una nueva función de tasa. Este experimento amplió el conocimiento actual de la represión y la regulación genética . [11]
Significado
Biología sintética
Los represores artificiales se descubrieron mediante la implantación de un bucle de inhibición sintético en E. coli . Esto representó la primera implementación de oscilaciones sintéticas en un organismo. Otras implicaciones de esto incluyen la posibilidad de rescatar sintéticamente componentes mutados de oscilaciones en organismos modelo. [7]
El represor artificial es un hito de la biología sintética que muestra que se pueden diseñar e implementar redes reguladoras genéticas para realizar funciones novedosas. Sin embargo, se encontró que las oscilaciones de las células se desfasaron después de un período de tiempo y la actividad del represor artificial fue influenciada por el crecimiento celular. El experimento inicial [7], por lo tanto, dio una nueva apreciación al reloj circadiano que se encuentra en muchos organismos, ya que los represores endógenos son significativamente más robustos que los represores artificiales implantados. Nuevas investigaciones en el Centro de Biología Cuantitativa de RIKEN han descubierto que las modificaciones químicas de una sola molécula de proteína podrían formar un oscilador autosostenible independiente de la temperatura. [12]
Los represores artificiales podrían ayudar potencialmente a la investigación y los tratamientos en campos que van desde la biología circadiana hasta la endocrinología. Son cada vez más capaces de demostrar la sincronización inherente a los sistemas biológicos naturales y los factores que los afectan. [13]
Biología circadiana
Una mejor comprensión del represor natural en organismos modelo con tiempos circadianos endógenos, como A. thaliana, tiene aplicaciones en la agricultura, especialmente en lo que respecta a la cría de plantas y el manejo del ganado. [14]
Referencias
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enlaces externos
- Enlace directo al modelo represor y una descripción en la base de datos de BioModels
- Una simulación del represor en R: https://gist.github.com/AndreyAkinshin/37f3e68a1576f9ea1e5c01f2fd64fe5e
- Una simulación en línea del represor: https://www.yschaerli.com/repressilator.html
- Un diagrama del sistema de bucles de retroalimentación en A. thaliana
- Enlace directo a información sobre el gen CCA1 y el papel que desempeña en A. thaliana