Una micromatriz de lisado de proteínas de fase inversa ( RPMA ) es una micromatriz de proteínas diseñada como una plataforma de transferencia de puntos que permite medir los niveles de expresión de proteínas en una gran cantidad de muestras biológicas simultáneamente de manera cuantitativa cuando se dispone de anticuerpos de alta calidad . [1]
Técnicamente, cantidades minúsculas de (a) lisados celulares, de células intactas o células microdiseccionadas capturadas con láser, (b) fluidos corporales como suero, LCR, orina, vítreo, saliva, etc., se inmovilizan en puntos individuales en una micromatriz que es luego se incuban con un único anticuerpo específico para detectar la expresión de la proteína diana en muchas muestras. [2] Está disponible un video resumen de RPPA. [3] Un microarray, según el diseño, puede acomodar cientos a miles de muestras que se imprimen en una serie de réplicas. La detección se realiza utilizando un anticuerpo marcado primario o secundario mediante quimioluminiscencia , fluorescencia o colorimétrica.Ensayos. A continuación, se obtienen imágenes de la matriz y se cuantifican los datos obtenidos.
La multiplexación se logra sondeando múltiples matrices manchadas con el mismo lisado con diferentes anticuerpos simultáneamente y se puede implementar como un ensayo calibrado cuantitativo. [4] Además, dado que RPMA puede utilizar lisados de células enteras o no diseccionadas o microdiseccionadas, puede proporcionar información cuantificable directa sobre proteínas modificadas postraduccionalmente que no son accesibles con otras técnicas de alto rendimiento. [5] [6] Por lo tanto, RPMA proporciona datos proteómicos de alta dimensión de una manera sensible y cuantitativa de alto rendimiento. [5] Sin embargo, dado que la señal generada por RPMA podría generarse a partir de la unión inespecífica de anticuerpos primarios o secundarios, como se ve en otras técnicas como ELISA o inmunohistoquímica, la señal de un solo punto podría deberse a reactividad cruzada . Por lo tanto, los anticuerpos utilizados en RPMA deben validarse cuidadosamente en cuanto a especificidad y rendimiento frente a lisados celulares mediante Western Blot . [1] [7]
La RPMA tiene varios usos, como el análisis cuantitativo de la expresión de proteínas en células cancerosas, fluidos corporales o tejidos para la elaboración de perfiles de biomarcadores , análisis de señalización celular y pronóstico clínico, diagnóstico o predicción terapéutica. [1] Esto es posible porque un RPMA con lisados de diferentes líneas celulares o biopsias de tejido microdiseccionadas por captura con láser de diferentes etapas de la enfermedad de varios órganos de uno o muchos pacientes se pueden construir para la determinación de la abundancia relativa o absoluta o la expresión diferencial de una proteína. nivel de marcador en un solo experimento. También se usa para monitorear la dinámica de las proteínas en respuesta a varios estímulos o dosis de medicamentos en múltiples puntos de tiempo. [1] Algunas otras aplicaciones para las que se utiliza RPMA incluyen la exploración y el mapeo de rutas de señalización de proteínas, la evaluación de objetivos de fármacos moleculares y la comprensión del mecanismo de acción de un fármaco candidato. [8] También se ha sugerido como una posible prueba de detección temprana en pacientes con cáncer para facilitar o guiar la toma de decisiones terapéuticas.
Otras micromatrices de proteínas incluyen las micromatrices de proteínas directas (PMA) y las micromatrices de anticuerpos (AMA). Los PMA inmovilizan proteínas recombinantes individuales purificadas y, a veces, desnaturalizadas en la micromatriz que se seleccionan mediante anticuerpos y otros compuestos pequeños. Los AMA inmovilizan los anticuerpos que capturan los analitos de la muestra aplicada en la micromatriz. [4] [6] La proteína diana se detecta mediante marcaje directo o un anticuerpo marcado secundario contra un epítopo diferente en la proteína diana del analito (enfoque sándwich). Tanto los PMA como los AMA pueden clasificarse como matrices de fase directa, ya que implican la inmovilización de un cebo para capturar un analito. En las matrices de fase directa, cada matriz se incuba con una muestra de prueba, como un lisado celular o el suero de un paciente, pero se analizan simultáneamente varios analitos de la muestra. [4] La Figura 1 muestra un microarray de proteínas de fase directa (usando un anticuerpo como cebo aquí) y de fase inversa a nivel molecular.
Diseño y procedimiento experimental
Dependiendo de la pregunta de investigación o del tipo y objetivo del estudio, el RPMA se puede diseñar seleccionando el contenido de la matriz, el número de muestras, la ubicación de la muestra dentro de las microplacas, la disposición de la matriz, el tipo de micromatriz, el anticuerpo de detección correcto, la señal método de detección, inclusión de control y control de calidad de las muestras. Luego, el experimento real se configura en el laboratorio y los resultados obtenidos se cuantifican y analizan. Las etapas experimentales se enumeran a continuación:
Coleccion de muestra
Las células se cultivan en matraces T-25 a 37 grados y CO2 al 5% en medio apropiado. [1] Dependiendo del diseño del estudio, después de que las células confluyan, podrían tratarse con fármacos, factores de crecimiento o podrían irradiarse antes del paso de lisis. Para los estudios del curso del tiempo, se agrega un estimulante a un conjunto de matraces al mismo tiempo y los matraces luego se procesan en diferentes puntos de tiempo. [1] Para los estudios de dosis de fármacos, se trata un conjunto de matraces con diferentes dosis del fármaco y todos los matraces se recogen al mismo tiempo. [1]
Si se va a realizar un lisado de fracción celular que contenga RPMA de un tejido o tejidos , se utilizan métodos de microdisección por captura con láser (LCM) o aspiración con aguja fina para aislar células específicas de una región de tejido microscópicamente. [4] [8]
Lisis celular
Los sedimentos de las células recogidas a través de cualquiera de los medios anteriores se lisan con un tampón de lisis celular para obtener una alta concentración de proteínas. [1]
Detección de anticuerpos
Se agrupan alícuotas de los lisados y se resuelven mediante SDS-PAGE bidimensional de un solo carril seguido de transferencia Western en una membrana de nitrocelulosa. La membrana se corta en tiras de cuatro milímetros y cada tira se prueba con un anticuerpo diferente. Las tiras con una sola banda indican anticuerpos específicos que son adecuados para el uso de RPMA. El rendimiento de los anticuerpos también debe validarse con un tamaño de muestra más pequeño en condiciones idénticas antes de la recolección real de la muestra para RPMA. [1] [7]
Construcción RPMA
Los lisados celulares se recogen y se diluyen en serie de seis a diez veces si se utilizan técnicas colorimétricas, o sin dilución cuando se utiliza la detección fluorimétrica (debido al mayor rango dinámico de fluorescencia que la detección colorimétrica). A continuación, las diluciones en serie se siembran en placas por duplicado en una placa de microtitulación de 384 o 1536 pocillos. [1] A continuación, los lisados se imprimen en portaobjetos de vidrio recubiertos con membrana de nitrocelulosa o PVDF mediante un micromatriz como el Aushon BioSystem 2470 o el robot Flexys (solución genómica). [1] [9] Aushon 2470 con un sistema de pasador sólido es la opción ideal, ya que se puede utilizar para producir matrices con lisados muy viscosos y tiene control ambiental de humedad y sistema de suministro de portaobjetos automatizado. [1] Dicho esto, hay artículos publicados que muestran que los pines de impresión de microarrays Arrayit también se pueden usar y producir microarrays con un rendimiento mucho mayor usando menos lisado. [10] Los portaobjetos de vidrio recubiertos con membrana están disponibles comercialmente en varias empresas diferentes, como Schleicher y Schuell Bioscience (ahora propiedad de GE Whatman www.whatman.com), [9] Grace BioLabs (www.gracebio.com), Thermo Scientific, y SCHOTT Nexterion (www.schott.com/nexterion). [11]
Detección de señales inmunoquímicas
Después de que se imprimen los portaobjetos, los sitios de unión no específicos en la matriz se bloquean usando un tampón de bloqueo como I-Block y las matrices se sondean con un anticuerpo primario seguido de un anticuerpo secundario. La detección generalmente se realiza con el sistema de amplificación de señal catalizada (CSA) DakoCytomation. Para la amplificación de la señal, los portaobjetos se incuban con el complejo estreptavidina-biotina-peroxidasa seguido de biotinil-tiramida / peróxido de hidrógeno y estreptavidina-peroxidasa. El revelado se completa con peróxido de hidrógeno y se obtienen barridos de los portaobjetos (1). La amplificación de la señal de tiramida funciona de la siguiente manera: la peroxidasa de rábano picante inmovilizada (HRP) convierte la tiramida en un intermedio reactivo en presencia de peróxido de hidrógeno. La tiramida activada se une a las proteínas vecinas cerca de un sitio donde se une la enzima HRP activadora. Esto conduce a una mayor deposición de moléculas de tiramida en el sitio; de ahí la amplificación de la señal. [12] [13]
Lance Liotta y Emanual Petricoin inventaron la técnica RPMA en 2001 (consulte la sección de historia a continuación) y han desarrollado un método de detección multiplexado utilizando técnicas fluorescentes de infrarrojo cercano. [14] En este estudio, informan sobre el uso de un enfoque dual basado en colorantes que puede duplicar efectivamente el número de puntos finales observados por matriz, lo que permite, por ejemplo, medir y analizar los niveles de proteína total y fosfoespecífica a la vez. .
Cuantificación y análisis de datos
Una vez que se ha realizado la inmunotinción, debe cuantificarse la expresión de proteínas. Los niveles de señal se pueden obtener usando el modo reflectante de un escáner óptico de superficie plana ordinario si se usa una técnica de detección colorimétrica [1] o mediante escaneo láser, como con un sistema TECAN LS, si se usan técnicas fluorescentes. A continuación, se pueden utilizar dos programas disponibles en línea (P-SCAN y ProteinScan) para convertir la imagen escaneada en valores numéricos. [1] Estos programas cuantifican las intensidades de la señal en cada punto y utilizan un algoritmo de interpolación de dosis (DI 25 ) para calcular un valor de nivel de expresión de proteína normalizado único para cada muestra. La normalización es necesaria para tener en cuenta las diferencias en la concentración de proteína total entre cada muestra y para que la tinción de anticuerpos se pueda comparar directamente entre muestras. [15] Esto se puede lograr realizando un experimento en paralelo en el que las proteínas totales se tiñen mediante tinción de proteína total de oro coloidal o tinción de proteína total Sypro Ruby . [1] Cuando se analizan múltiples RPMA, los valores de intensidad de la señal se pueden mostrar como un mapa de calor, lo que permite el análisis de agrupamiento bayesiano y el perfil de las vías de señalización. [15] Una herramienta de software óptima, diseñada a medida para los RPMA, se llama Microvigene, de Vigene Tech, Inc.
Fortalezas
La mayor ventaja de los RPMA es que permiten una detección de proteínas ultrasensible, multiplexada y de alto rendimiento a partir de cantidades extremadamente pequeñas de material de entrada, una hazaña que no se puede realizar mediante la técnica de transferencia Western convencional o ELISA . [1] [9] El pequeño tamaño de la mancha en el microarray, que varía en diámetro de 85 a 200 micrómetros, permite el análisis de miles de muestras con el mismo anticuerpo en un experimento. [9] Los RPMA tienen una mayor sensibilidad y son capaces de detectar proteínas en el rango de picogramos. [9] Algunos investigadores incluso han informado de la detección de proteínas en el rango de attogramas. [9] Esta es una mejora significativa con respecto a la detección de proteínas por ELISA , que requiere cantidades de microgramos de proteína (6). El aumento de la sensibilidad de los RPMA se debe al formato en miniatura de la matriz, que conduce a un aumento en la densidad de la señal (intensidad de la señal / área) [9] junto con una mejora habilitada para la deposición de tiramida. La alta sensibilidad de los RPMA permite la detección de proteínas de baja abundancia o biomarcadores , como proteínas de señalización fosforiladas, a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida, como muestras de biopsia , que a menudo están contaminadas con tejido normal. [4] Utilizando lisados de microdisección por captura láser se pueden analizar desde tan solo 10 células, [4] y cada mancha contiene menos de una centésima parte de un equivalente celular de proteína.
Una gran mejora de los RPMA con respecto a las matrices de proteínas de fase avanzada tradicionales es una reducción en la cantidad de anticuerpos necesarios para detectar una proteína. Las matrices de proteínas de fase directa suelen utilizar un método sándwich para capturar y detectar la proteína deseada. [4] [15] Esto implica que debe haber dos epítopos en la proteína (uno para capturar la proteína y otro para detectar la proteína) para los cuales hay anticuerpos específicos disponibles. [15] Otras micromatrices de proteínas de fase directa etiquetan directamente las muestras, sin embargo, a menudo existe una variabilidad en la eficiencia del etiquetado para diferentes proteínas y, a menudo, el etiquetado destruye el epítopo al que se une el anticuerpo. [15] Los RPMA superan este problema, ya que no es necesario etiquetar directamente la muestra.
Otra ventaja de los RPMA sobre los microarrays de proteínas de fase directa y la transferencia Western es la uniformidad de los resultados, ya que todas las muestras del chip se sondean con el mismo anticuerpo primario y secundario y la misma concentración de reactivos de amplificación durante el mismo período de tiempo. [9] Esto permite cuantificar las diferencias en los niveles de proteínas en todas las muestras. Además, la impresión de cada muestra en el chip en dilución en serie (colorimétrica) proporciona un control interno para garantizar que el análisis se realice solo en el rango dinámico lineal del ensayo. [4] De manera óptima, la impresión de calibradores y controles altos y bajos directamente en el mismo chip proporcionará una capacidad incomparable para medir cuantitativamente cada proteína a lo largo del tiempo y entre experimentos. Un problema que se encuentra con las micromatrices de tejido es la recuperación de antígenos y la subjetividad inherente de la inmunohistoquímica. Los anticuerpos, especialmente los reactivos fosfoespecíficos, a menudo detectan secuencias de péptidos lineales que pueden estar enmascaradas debido a la conformación tridimensional de la proteína. [15] Este problema se supera con los RPMA, ya que las muestras se pueden desnaturalizar, revelando cualquier epítopo oculto. [15]
Debilidades
La mayor limitación de RPMA, como es el caso de todos los inmunoensayos, es su dependencia de anticuerpos para la detección de proteínas. Actualmente existe un número limitado pero en rápido crecimiento de proteínas de señalización para las que existen anticuerpos que dan una señal analizable. [15] Además, encontrar el anticuerpo apropiado podría requerir un examen exhaustivo de muchos anticuerpos mediante transferencia Western antes de comenzar el análisis RPMA. [1] Para superar este problema, se han creado dos bases de datos de recursos abiertos para mostrar los resultados de la transferencia Western para los anticuerpos que tienen una buena especificidad de unión dentro del rango esperado. [1] [16] [17] Además, los RPMA, a diferencia de las transferencias Western, no resuelven las fracciones de proteínas por peso molecular. [1] Por lo tanto, es fundamental que se realice la validación de anticuerpos por adelantado.
Historia
RPMA se introdujo por primera vez en 2001 en un artículo de Lance Liotta y Emanuel Petricoin, quienes inventaron la tecnología. [8] Los autores utilizaron la técnica para analizar con éxito el estado de la proteína del punto de control de supervivencia en la etapa de transición microscópica mediante microdisección de captura con láser del epitelio de próstata histológicamente normal, neoplasia intraepitelial de próstata y cáncer de próstata invasivo emparejado con el paciente. [8] Desde entonces, el RPMA se ha utilizado en muchas investigaciones biológicas, traslacionales y clínicas básicas. Además, la técnica se ha incluido por primera vez en ensayos clínicos mediante los cuales se eligen pacientes con cáncer colorrectal y de mama metastásico para la terapia en función de los resultados de la RPMA. Esta técnica ha sido comercializada para aplicaciones personalizadas basadas en la medicina por Theranostics Health, Inc.
Referencias
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enlaces externos
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