Marcado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular
De Wikipedia, la enciclopedia libre
  (Redirigido desde SILAC )
Saltar a navegación Saltar a búsqueda
El principio de SILAC . Las células se marcan diferencialmente haciéndolas crecer en medio ligero con arginina normal (Arg-0, color azul) o medio con arginina pesada (Arg-6, color rojo). La incorporación metabólica de los aminoácidos a las proteínas da como resultado un desplazamiento de masa de los péptidos correspondientes. Este cambio de masa puede detectarse mediante un espectrómetro de masas, como lo indican los espectros de masas representados. Cuando se combinan ambas muestras, la relación de las intensidades de los picos en el espectro de masas refleja la abundancia relativa de proteínas. En este ejemplo, la proteína marcada tiene la misma abundancia en ambas muestras (proporción 1).

El marcaje de isótopos estables por / con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC ) es una técnica basada en espectrometría de masas que detecta diferencias en la abundancia de proteínas entre muestras utilizando marcaje isotópico no radiactivo . [1] [2] [3] [4] Es un método popular para la proteómica cuantitativa .

Procedimiento

Se cultivan dos poblaciones de células en cultivo celular . Una de las poblaciones de células se alimenta con medio de crecimiento que contiene aminoácidos normales . Por el contrario, la segunda población se alimenta con medio de crecimiento que contiene aminoácidos marcados con isótopos pesados ​​estables (no radiactivos) . Por ejemplo, el medio puede contener arginina marcada con seis átomos de carbono 13 ( 13 C) en lugar del carbono 12 normal ( 12 C). Cuando las células crecen en este medio, incorporan la arginina pesada en todas sus proteínas. A partir de entonces, todos los péptidos que contienen una sola arginina son 6 Damás pesado que sus contrapartes normales. Alternativamente, se puede utilizar un etiquetado uniforme con 13 C o 15 N. El truco es que las proteínas de ambas poblaciones celulares se pueden combinar y analizar juntas mediante espectrometría de masas . Los pares de péptidos químicamente idénticos de diferente composición de isótopos estables se pueden diferenciar en un espectrómetro de masas debido a su diferencia de masa. La proporción de intensidades de pico en el espectro de masas para tales pares de péptidos refleja la proporción de abundancia para las dos proteínas. [5] [3]

Aplicaciones

Se ha utilizado un enfoque SILAC que implica la incorporación de tirosina marcada con nueve átomos de carbono 13 ( 13 C) en lugar del carbono 12 normal ( 12 C) para estudiar los sustratos de tirosina quinasa en las vías de señalización. [6] SILAC ha surgido como un método muy poderoso para estudiar la señalización celular , modificaciones posteriores a la traducción como la fosforilación , [6] [7] la interacción proteína-proteína y la regulación de la expresión génica . Además, SILAC se ha convertido en un método importante en la secretomía , el estudio global de las proteínas secretadas.y vías secretoras. [8] Se puede utilizar para distinguir entre proteínas secretadas por células en cultivo y contaminantes del suero. [9] También se han publicado protocolos estandarizados de SILAC para diversas aplicaciones. [10] [11]

Si bien SILAC se había utilizado principalmente en el estudio de células eucariotas y cultivos celulares, recientemente se había empleado en bacterias y su biopelícula multicelular en la tolerancia a los antibióticos, para diferenciar la tolerancia y las subpoblaciones sensibles. [12]

SILAC pulsado

SILAC pulsado (pSILAC) es una variación del método SILAC en el que los aminoácidos marcados se añaden al medio de cultivo durante un breve período de tiempo. Esto permite monitorear las diferencias en la producción de proteína de novo en lugar de la concentración cruda. [13]

También se ha utilizado para estudiar la tolerancia de la biopelícula a los antibióticos para diferenciar subpoblaciones tolerantes y sensibles [12]

NeuCode SILAC

Tradicionalmente, el nivel de multiplexación en SILAC estaba limitado debido a la cantidad de isótopos de SILAC disponibles. Recientemente, una nueva técnica llamada NeuCode (codificación de neutrones) SILAC ha aumentado el nivel de multiplexación que se puede lograr con el etiquetado metabólico (hasta 4). [14] El método de aminoácidos NeuCode es similar al SILAC pero se diferencia en que el etiquetado solo utiliza aminoácidos pesados. El uso de solo aminoácidos pesados ​​elimina la necesidad de incorporar al 100% los aminoácidos necesarios para SILAC. La mayor capacidad de multiplexación de los aminoácidos NeuCode se debe al uso de defectos de masa de neutrones adicionales en los isótopos estables. Sin embargo, estas pequeñas diferencias de masa deben resolverse en espectrómetros de masas de alta resolución.

Referencias

  1. ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (junio de 1999). "Cuantificación precisa de la expresión de proteínas y fosforilación específica del sitio" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 96 (12): 6591–6. Código Bibliográfico : 1999PNAS ... 96.6591O . doi : 10.1073 / pnas.96.12.6591 . PMC  21959 . PMID  10359756 .
  2. ^ Jiang H, inglés AM (2002). "Análisis cuantitativo del proteoma de levadura por incorporación de leucina marcada isotópicamente". J. Proteome Res . 1 (4): 345–50. doi : 10.1021 / pr025523f . PMID 12645890 . 
  3. ↑ a b Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (mayo de 2002). "Marcado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular, SILAC, como un enfoque simple y preciso para la expresión proteómica" . Mol. Celda. Proteómica . 1 (5): 376–86. doi : 10.1074 / mcp.M200025-MCP200 . PMID 12118079 . 
  4. ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). "Marcado de isótopos estables específicos de residuos de aminoácidos para proteómica cuantitativa" . Rapid Commun. Mass Spectrom . 16 (22): 2115-23. Código Bib : 2002RCMS ... 16.2115Z . doi : 10.1002 / rcm.831 . PMID 12415544 . 
  5. ^ Schoeters, Floris; Van Dijck, Patrick (2019). "Interacciones proteína-proteína en Candida albicans" . Fronteras en microbiología . 10 : 1792. doi : 10.3389 / fmicb.2019.01792 . ISSN 1664-302X . PMC 6693483 . PMID 31440220 .   
  6. ↑ a b Ibarrola N, Molina H, Iwahori A, Pandey A (abril de 2004). "Un nuevo enfoque proteómico para la identificación específica de sustratos de tirosina quinasa utilizando [13C] tirosina" . J. Biol. Chem . 279 (16): 15805-13. doi : 10.1074 / jbc.M311714200 . PMID 14739304 . 
  7. ^ Ibarrola N, Kalume DE, Gronborg M, Iwahori A, Pandey A (noviembre de 2003). "Un enfoque proteómico para la cuantificación de la fosforilación utilizando marcaje de isótopos estables en cultivo celular". Anal. Chem . 75 (22): 6043–9. doi : 10.1021 / ac034931f . PMID 14615979 . 
  8. ^ Hathout Y (abril de 2007). "Aproximaciones al estudio del secretoma celular". Expert Rev Proteomics . 4 (2): 239–48. doi : 10.1586 / 14789450.4.2.239 . PMID 17425459 . S2CID 26169223 .  
  9. ↑ Polacek, Martin; Bruun, Jack-Ansgar; Johansen, Oddmund; Martínez, Íñigo (2010). "Diferencias en el secretoma de explantes de cartílago y condrocitos cultivados develados por tecnología SILAC". Revista de investigación ortopédica . 28 (8): 1040–9. doi : 10.1002 / jor.21067 . PMID 20108312 . S2CID 41057768 .  
  10. ^ Amanchy R, Kalume DE, Pandey A (enero de 2005). "Marcado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para estudiar la dinámica de la abundancia de proteínas y modificaciones postraduccionales" . Sci. STKE . 2005 (267): pl2. doi : 10.1126 / stke.2672005pl2 . PMID 15657263 . S2CID 12089034 .  
  11. ^ Harsha HC, Molina H, Pandey A (2008). "Proteómica cuantitativa utilizando marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular" . Nat Protocol . 3 (3): 505–16. doi : 10.1038 / nprot.2008.2 . PMID 18323819 . S2CID 24190501 .  
  12. ↑ a b Chua SL, Yam JK, Sze KS, Yang L (2016). "Etiquetado selectivo y erradicación de poblaciones bacterianas tolerantes a antibióticos en biofilms de Pseudomonas aeruginosa" . Nat Commun . 7 : 10750. Bibcode : 2016NatCo ... 710750C . doi : 10.1038 / ncomms10750 . PMC 4762895 . PMID 26892159 .  
  13. ^ Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M (enero de 2009). "Análisis global de la traducción de proteínas celulares por SILAC pulsado". Proteómica . 9 (1): 205–9. doi : 10.1002 / pmic.200800275 . PMID 19053139 . S2CID 23130202 .  
  14. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC, Wood WW, El Masri M, Westphall MS, Gasch AP, Coon JJ (septiembre de 2014). "Etiquetas NeuCode para la cuantificación relativa de proteínas" . Mol. Celda. Proteómica . 13 (9): 2503–12. doi : 10.1074 / mcp.M114.040287 . PMC 4159665 . PMID 24938287 .  

Otras lecturas

  • Ong SE, Kratchmarova I, Mann M (2003). "Propiedades de la arginina sustituida con 13C en el marcaje de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular (SILAC)" . Revista de investigación del proteoma . 2 (2): 173–81. doi : 10.1021 / pr0255708 . PMID  12716131 .
  • Ong SE, Mann M (2006). "Una receta práctica para el marcado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular (SILAC)" . Protocolos de la naturaleza . 1 (6): 2650–60. doi : 10.1038 / nprot.2006.427 . PMID  17406521 . S2CID  10651610 .
  • Ong SE, Mann M (2007). "Marcado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular para proteómica cuantitativa". Proteómica cuantitativa por espectrometría de masas . Métodos en Biología Molecular. 359 . págs. 37–52. doi : 10.1007 / 978-1-59745-255-7_3 . ISBN 978-1-58829-571-2. PMID  17484109 .

enlaces externos

  • Recurso de SILAC Mann Lab
  • Recurso de SILAC Pandey Lab
  • Centro de recursos SILAC para bioinformática experimental (CEBI)
Obtenido de " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Stable_isotope_labeling_by_amino_acids_in_cell_culture&oldid=993521952 "
Contribute a better translation