La proteómica cuantitativa es una técnica de química analítica para determinar la cantidad de proteínas en una muestra. [1] [2] [3] Los métodos para la identificación de proteínas son idénticos a los utilizados en la proteómica general (es decir, cualitativa) , pero incluyen la cuantificación como una dimensión adicional. En lugar de simplemente proporcionar listas de proteínas identificadas en una determinada muestra, la proteómica cuantitativa proporciona información sobre las diferencias fisiológicas entre dos muestras biológicas. Por ejemplo, este enfoque se puede utilizar para comparar muestras de pacientes sanos y enfermos. La proteómica cuantitativa se realiza principalmente mediante electroforesis en gel bidimensional.(2-DE) o espectrometría de masas (MS). Sin embargo, un método desarrollado recientemente de análisis de transferencia de puntos cuantitativos (QDB) es capaz de medir tanto la cantidad absoluta como relativa de una proteína individual en la muestra en un formato de alto rendimiento, abriendo así una nueva dirección para la investigación proteómica. A diferencia de 2-DE, que requiere MS para la identificación de proteínas aguas abajo, la tecnología MS puede identificar y cuantificar los cambios.
Cuantificación mediante espectrofotometría
La concentración de una determinada proteína en una muestra se puede determinar mediante procedimientos espectrofotométricos. [4] La concentración de una proteína se puede determinar midiendo la DO a 280 nm en un espectrofotómetro, que se puede utilizar con un ensayo de curva estándar para cuantificar la presencia de triptófano, tirosina y fenilalanina. [5] Sin embargo, este método no es el más preciso porque la composición de las proteínas puede variar mucho y este método no podría cuantificar las proteínas que no contienen los aminoácidos antes mencionados. Este método también es inexacto debido a la posibilidad de contaminación por ácidos nucleicos. Otros procedimientos espectrofotométricos más precisos para la cuantificación de proteínas incluyen los métodos de Biuret , Lowry , BCA y Bradford .
Cuantificación mediante electroforesis bidimensional
La electroforesis en gel bidimensional (2-DE) representa una de las principales tecnologías para la proteómica cuantitativa con ventajas y desventajas. 2-DE proporciona información sobre la cantidad de proteína, la carga y la masa de la proteína intacta. Tiene limitaciones para el análisis de proteínas mayores de 150 kDa o menores de 5 kDa y proteínas de baja solubilidad. La EM cuantitativa tiene una mayor sensibilidad pero no proporciona información sobre la proteína intacta.
El 2-DE clásico basado en tinción post-electroforética tiene limitaciones: se requieren al menos tres réplicas técnicas para verificar la reproducibilidad. [ cita requerida ] La electroforesis en gel de diferencia (DIGE) utiliza el etiquetado de las proteínas basado en fluorescencia antes de la separación y ha aumentado la precisión de la cuantificación, así como la sensibilidad en la detección de proteínas. [ cita requerida ] Por lo tanto, DIGE representa el enfoque principal actual para el estudio de proteomas basado en 2-DE. [ cita requerida ]
Cuantificación mediante espectrometría de masas
La espectrometría de masas (MS) representa una de las principales tecnologías para la proteómica cuantitativa con ventajas y desventajas. La EM cuantitativa tiene una mayor sensibilidad, pero solo puede proporcionar información limitada sobre la proteína intacta. La EM cuantitativa se ha utilizado tanto para el descubrimiento como para el análisis proteómico dirigido para comprender la dinámica proteómica global en poblaciones de células (análisis masivo) [7] o en células individuales (análisis de una sola célula). [8] [9]
Los primeros enfoques desarrollados en la década de 1990 aplicaron etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT), que utilizan dos reactivos con isótopos pesados y ligeros, respectivamente, y una etiqueta de afinidad de biotina para modificar péptidos que contienen cisteína. Esta tecnología se ha utilizado para etiquetar células enteras de Saccharomyces cerevisiae , [10] y, junto con la espectrometría de masas , ayudó a sentar las bases de la proteómica cuantitativa. Este enfoque ha sido reemplazado por etiquetas de masa isobáricas, [7] que también se utilizan para el análisis de proteínas unicelulares. [11]
Cuantificación relativa y absoluta
La espectrometría de masas no es inherentemente cuantitativa debido a las diferencias en la eficiencia de ionización y / o detectabilidad de los muchos péptidos en una muestra dada, lo que ha provocado el desarrollo de métodos para determinar la abundancia relativa y absoluta de proteínas en las muestras. [3] La intensidad de un pico en un espectro de masas no es un buen indicador de la cantidad de analito en la muestra, aunque las diferencias en la intensidad máxima del mismo analito entre varias muestras reflejan con precisión diferencias relativas en su abundancia.
Marcado de isótopos estables en espectrometría de masas
Etiquetas de isótopos estables
Un enfoque para la cuantificación relativa que es más costoso y requiere más tiempo, aunque menos sensible al sesgo experimental que la cuantificación sin etiqueta, implica etiquetar las muestras con etiquetas de isótopos estables que permiten que el espectrómetro de masas distinga entre proteínas idénticas en muestras separadas. Un tipo de marcador, los marcadores isotópicos, consisten en isótopos estables incorporados en entrecruzadores de proteínas que provocan un desplazamiento de masa conocido de la proteína o péptido marcado en el espectro de masas. Las muestras marcadas diferencialmente se combinan y analizan juntas, y las diferencias en las intensidades máximas de los pares de isótopos reflejan con precisión la diferencia en la abundancia de las proteínas correspondientes.
La cuantificación proteómica absoluta usando péptidos isotópicos implica agregar concentraciones conocidas de isotopólogos pesados sintéticos de péptidos diana en una muestra experimental y luego realizar LC-MS / MS. Al igual que con la cuantificación relativa utilizando marcadores isotópicos, péptidos de igual química coeluyen y se analizan mediante MS simultáneamente. Sin embargo, a diferencia de la cuantificación relativa, la abundancia del péptido diana en la muestra experimental se compara con la del péptido pesado y se calcula de nuevo a la concentración inicial del estándar usando una curva estándar predeterminada para producir la cuantificación absoluta del blanco. péptido.
Los métodos de cuantificación relativa incluyen etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT), etiquetado isobárico ( etiquetas de masa en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ)), etiquetas codificadas por metales de cuantificación sin etiquetas ( MeCAT ), N-terminal marcaje , marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC ) y marcaje isotópico de amina terminal de sustratos (TAILS). Ha surgido un enfoque matemáticamente riguroso que integra intensidades de péptidos y concordancia de medición de péptidos en intervalos de confianza para las proporciones de proteínas. [12]
La cuantificación absoluta se realiza mediante el control de la reacción seleccionada (SRM).
Etiquetas con código de metal
El método de etiquetas codificadas por metales (MeCAT) se basa en el etiquetado químico, pero en lugar de utilizar isótopos estables, se utilizan diferentes iones lantánidos en complejos macrocíclicos. La información cuantitativa proviene de mediciones de EM en plasma acopladas inductivamente de los péptidos marcados. MeCAT se puede utilizar en combinación con espectrometría de masas elemental ICP-MS, lo que permite la cuantificación absoluta por primera vez del metal unido por el reactivo MeCAT a una proteína o biomolécula. Por lo tanto, es posible determinar la cantidad absoluta de proteína hasta el rango de attomol utilizando una calibración externa mediante una solución estándar de metal. Es compatible con la separación de proteínas mediante electroforesis 2D y cromatografía en experimentos multiplex. La identificación de proteínas y la cuantificación relativa se pueden realizar mediante MALDI-MS / MS y ESI-MS / MS.
Los espectrómetros de masas tienen una capacidad limitada para detectar péptidos de baja abundancia en muestras con un alto rango dinámico. El ciclo de trabajo limitado de los espectrómetros de masas también restringe la tasa de colisión, lo que resulta en un submuestreo [13] Los protocolos de preparación de muestras representan fuentes de sesgo experimental.
Marcado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular
El marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC ) es un método que implica la incorporación metabólica de aminoácidos marcados con C o N "pesados" en proteínas, seguida de análisis de EM. SILAC requiere el crecimiento de células en medios especializados complementados con formas ligeras o pesadas de aminoácidos esenciales, lisina o arginina. Se cultiva una población de células en medios que contienen aminoácidos ligeros mientras que la condición experimental se cultiva en presencia de aminoácidos pesados. Los aminoácidos pesados y ligeros se incorporan a las proteínas a través de la síntesis de proteínas celulares. Después de la lisis celular, se combinan cantidades iguales de proteína de ambas condiciones y se someten a digestión proteotípica. Se eligieron los aminoácidos de arginina y lisina porque la tripsina, la enzima predominante utilizada para generar péptidos proteotípicos para el análisis de EM, se escinde en el extremo C de lisina y arginina. Después de la digestión con tripsina, todos los péptidos trípticos de células cultivadas en medio SILAC tendrían al menos un aminoácido marcado, lo que da como resultado un cambio de masa constante de la muestra marcada sobre la no marcada. Debido a que los péptidos que contienen aminoácidos pesados y ligeros son químicamente idénticos, se coeluyen durante el fraccionamiento en columna de fase inversa y se detectan simultáneamente durante el análisis de MS. La abundancia relativa de proteínas está determinada por las intensidades relativas de los picos de los péptidos isotópicamente distintos.
Tradicionalmente, el nivel de multiplexación en SILAC estaba limitado debido a la cantidad de isótopos de SILAC disponibles. Recientemente, una nueva técnica llamada NeuCode SILAC, [14] ha aumentado el nivel de multiplexación que se puede lograr con el etiquetado metabólico (hasta 4). El método de aminoácidos de NeuCode es similar al SILAC pero se diferencia en que el etiquetado solo utiliza aminoácidos pesados. El uso de solo aminoácidos pesados elimina la necesidad de incorporar al 100% los aminoácidos necesarios para SILAC. La mayor capacidad de multiplexación de los aminoácidos NeuCode se debe al uso de defectos de masa de neutrones adicionales en los isótopos estables. Sin embargo, estas pequeñas diferencias de masa deben resolverse en espectrómetros de masas de alta resolución.
Uno de los principales beneficios de SILAC es que el nivel de sesgo de cuantificación de los errores de procesamiento es bajo porque las muestras pesadas y ligeras se combinan antes de la preparación de la muestra para el análisis de MS. SILAC y NeuCode SILAC son excelentes técnicas para detectar pequeños cambios en los niveles de proteínas o modificaciones postraduccionales entre grupos experimentales.
Etiquetado isobárico
Las etiquetas de masa isobárica (etiquetas de masa en tándem) son etiquetas que tienen propiedades químicas y de masa idénticas que permiten que los isotopólogos pesados y ligeros coeluyan juntos. Todas las etiquetas de masa constan de un indicador de masa que tiene un número único de sustituciones de 13 C, un normalizador de masa que tiene una masa única que equilibra la masa de la etiqueta para hacer que todas las etiquetas sean iguales en masa y una fracción reactiva que se reticula con los péptidos. . Estas etiquetas están diseñadas para escindirse en una región enlazadora específica en CID de alta energía, produciendo etiquetas de diferentes tamaños que luego se cuantifican mediante LC-MS / MS. Las muestras de proteínas o péptidos preparadas a partir de células, tejidos o fluidos biológicos se marcan en paralelo con las etiquetas de masa isobárica y se combinan para su análisis. La cuantificación de proteínas se logra comparando las intensidades de los iones indicadores en los espectros MS / MS. Hay disponibles tres tipos de etiquetas de masa en tándem con diferente reactividad: (1) éster reactivo de NHS que proporciona un etiquetado específico de amina de alta eficiencia (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex y TMT11plex), (2) grupo de función yodacetilo reactivo que marca sulfhidrilo- ( -SH) (iodoTMT) y (3) grupo funcional alcoxiamina reactivo que proporciona un marcaje covalente de compuestos que contienen carbonilo (aminoxyTMT).
Un beneficio clave del etiquetado isobárico sobre otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, SILAC, ICAT, sin etiquetas) es el aumento de las capacidades de multiplexación y, por lo tanto, el aumento del potencial de rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una ejecución de LC-MS elimina la necesidad de analizar varios conjuntos de datos y elimina la variación de ejecución a ejecución. La multiplexación reduce la variabilidad del procesamiento de muestras, mejora la especificidad al cuantificar las proteínas de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de hasta 11 muestras experimentales.
Cuantificación sin etiquetas en espectrometría de masas
Un enfoque para la cuantificación relativa es analizar muestras por separado mediante MS y comparar los espectros para determinar la abundancia de péptidos en una muestra en relación con otra, como en las estrategias sin etiquetas . En general, se acepta que, si bien la cuantificación sin etiquetas es el menos preciso de los paradigmas de cuantificación, también es económica y confiable cuando se somete a una fuerte validación estadística. Hay dos métodos diferentes de cuantificación en proteómica cuantitativa sin marcaje: AUC (área bajo la curva) y recuento espectral.
Métodos de cuantificación sin etiqueta
El AUC es un método mediante el cual para un espectro de péptidos dado en una ejecución de LC-MS, se calcula el área bajo el pico espectral. Las mediciones de los picos de AUC son linealmente proporcionales a la concentración de proteína en una mezcla de analitos determinada. La cuantificación se logra mediante recuentos de iones, la medición de la cantidad de un ión en un tiempo de retención específico. [15] Se requiere discreción para la estandarización de los datos brutos. [16] El espectrómetro de alta resolución puede aliviar los problemas que surgen al intentar hacer que los datos sean reproducibles, sin embargo, gran parte del trabajo relacionado con la normalización de datos se puede realizar a través de software como OpenMS y MassView. [17]
El conteo espectral implica contar los espectros de una proteína identificada y luego estandarizar usando alguna forma de normalización. [18] Normalmente, esto se hace con una abundante selección de masa de péptidos (MS) que luego se fragmenta y luego se cuentan los espectros MS / MS. [15] Se requieren múltiples muestreos del pico de proteína para una estimación precisa de la abundancia de proteína debido a la compleja naturaleza fisicoquímica de los péptidos. Por tanto, la optimización para experimentos de EM / EM es una preocupación constante. Una alternativa para solucionar este problema es utilizar una técnica independiente de los datos que alterna entre energías de colisión altas y bajas. Por tanto, se recopila un gran estudio de todos los posibles iones precursores y productos. Sin embargo, esto está limitado por la capacidad del software de espectrometría de masas para reconocer y hacer coincidir los patrones de asociación de péptidos entre el precursor y los iones del producto.
Aplicaciones
Aplicaciones biomédicas
La proteómica cuantitativa tiene distintas aplicaciones en el campo médico. Especialmente en los campos del descubrimiento de fármacos y biomarcadores. Las técnicas de LC-MS / MS han comenzado a tomar métodos más tradicionales como el western blot y ELISA debido a la naturaleza engorrosa de etiquetar proteínas diferentes y separarlas utilizando estos métodos y el análisis más global de la cuantificación de proteínas. Los métodos de espectrometría de masas son más sensibles a la diferencia en la estructura de la proteína como la modificación postraduccional y, por lo tanto, pueden cuantificar diferentes modificaciones de las proteínas. La proteómica cuantitativa puede eludir estos problemas, solo necesitando información de secuencia para ser realizada. Sin embargo, deben tenerse en cuenta las desventajas en cuanto a sensibilidad y tiempo de análisis. [20]
Descubrimiento de medicamento
La proteómica cuantitativa tiene las aplicaciones más importantes en la identificación de objetivos de proteínas, validación de objetivos de proteínas y perfiles de toxicidad del descubrimiento de fármacos . [21] El descubrimiento de fármacos se ha utilizado para investigar la interacción proteína-proteína y, más recientemente, las interacciones fármaco-molécula pequeña. Por lo tanto, se ha mostrado muy prometedor en el seguimiento de los efectos secundarios de pequeñas moléculas similares a fármacos y en la comprensión de la eficacia y el efecto terapéutico de un fármaco diana sobre otro. [22] [23] Una de las metodologías más típicas para la cuantificación absoluta de proteínas en el descubrimiento de fármacos es el uso de LC-MS / MS con monitoreo de reacciones múltiples (MRM). La espectrometría de masas se realiza típicamente mediante una MS de triple cuadrupolo . [21]
Ver también
- Ensayo de proteína Pierce
- Espectrometría de masas de proteínas
Referencias
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