La desorción / ionización láser de superficie mejorada ( SELDI ) es un método de ionización suave en espectrometría de masas (MS) utilizado para el análisis de mezclas de proteínas . Es una variación de la desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI). [1] [2] En MALDI, la muestra se mezcla con un material de matriz y se aplica a una placa de metal antes de la irradiación con láser, [3] mientras que en SELDI, las proteínas de interés en una muestra se unen a una superficie antes del análisis de EM. . La superficie de la muestra es un componente clave en la purificación , desorción e ionización de la muestra. SELDI se usa típicamente conespectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF) y se utiliza para detectar proteínas en muestras de tejido, sangre , orina u otras muestras clínicas; sin embargo, la tecnología SELDI se puede utilizar potencialmente en cualquier aplicación simplemente modificando la superficie de la muestra. [1] [2]
Acrónimo | SELDI |
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Analitos | Biomoléculas |
Otras tecnicas | |
Relacionados | Desorción / ionización láser asistida por matriz Desorción láser suave Desorción / ionización láser asistida por superficie |
Preparación e instrumentación de muestras
SELDI puede verse como una combinación de cromatografía en fase sólida y TOF-MS. La muestra se aplica a una superficie de chip modificada, lo que permite la unión específica de proteínas de la muestra a la superficie. Luego, los contaminantes y las proteínas no unidas se eliminan por lavado. Después de lavar la muestra, se aplica una matriz absorbente de energía, como ácido sinapínico (SPA) o ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), a la superficie y se deja cristalizar con la muestra. [1] [2] Alternativamente, la matriz se puede unir a la superficie de la muestra mediante modificación covalente o adsorción antes de aplicar la muestra. [4] Luego, la muestra se irradia con un láser pulsado, lo que provoca la ablación y desorción de la muestra y la matriz. [1] [2]
SELDI-TOF-MS
Las muestras ubicadas en una superficie SELDI se analizan típicamente usando espectrometría de masas de tiempo de vuelo. Un láser de irradiación ioniza péptidos de cristales de la mezcla muestra / matriz. La matriz absorbe la energía del pulso láser, lo que evita la destrucción de la molécula y transfiere la carga a las moléculas de la muestra, formando iones. Luego, los iones se aceleran brevemente a través de un potencial eléctrico y viajan por un tubo de vuelo sin campo donde están separados por sus diferencias de velocidad . La relación masa-carga de cada ion se puede determinar a partir de la longitud del tubo, la energía cinética que el campo eléctrico da a los iones y la velocidad de los iones en el tubo. La velocidad de los iones es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la relación masa-carga del ion; Los iones con relaciones de masa a carga bajas se detectan antes que los iones con relaciones de masa a carga elevadas. [5]
Superficie SELDI
La unión de proteínas a la superficie SELDI actúa como un paso de separación cromatográfica en fase sólida y, como resultado, las proteínas adheridas a la superficie son más fáciles de analizar. La superficie está compuesta principalmente de materiales con una variedad de características físico-químicas, iones metálicos o intercambiadores de aniones o cationes. Las superficies comunes incluyen CM10 ( intercambio catiónico débil ), H50 (superficie hidrófoba, similar a la cromatografía de fase inversa C 6- C 12 ), IMAC30 (superficie de unión a metales) y Q10 (intercambio aniónico fuerte). Las superficies SELDI también se pueden modificar para estudiar la unión de ADN-proteína, ensayos de anticuerpo-antígeno e interacciones receptor-ligando. [2]
Métodos de superficie adicionales
El proceso SELDI es una combinación de desorción pura mejorada en la superficie (SEND), captura por afinidad mejorada en la superficie (SEAC) y espectrometría de masas de unión y liberación fotolábil mejorada en la superficie (SEPAR). Con SEND, los analitos se pueden desorber e ionizar sin agregar una matriz; la matriz se incorpora a la superficie de la muestra. En SEAC, la superficie de la muestra se modifica para unir el analito de interés para el análisis con espectrometría de masas de desorción / ionización por láser (LDI-MS). [1] [4] [6] SEPAR es una combinación de SEND y SEAC; la superficie de la muestra modificada también actúa como una matriz de absorción de energía para la ionización. [4]
Historia
La tecnología SELDI fue desarrollada por T. William Hutchens y Tai-Tung Yip en el Baylor College of Medicine en 1993. [7] Hutchens y Yip unieron ADN monocatenario a perlas de agarosa y usaron las perlas para capturar lactoferrina , una glicoproteína que se une al hierro , de la orina del lactante prematuro. Las perlas se incubaron en la muestra y luego se retiraron, lavaron y analizaron con una punta de sonda MALDI-MS. Esta investigación llevó a la idea de que las superficies MALDI podrían derivatizarse con dispositivos SEAC; la técnica fue descrita más tarde por Hutchens y Yip en 1998. [1] [7]
La tecnología SELDI fue comercializada por primera vez por Ciphergen Biosystems en 1997 como el sistema ProteinChip, y ahora es producida y comercializada por Bio-Rad Laboratories. [6]
Aplicaciones
La tecnología SELDI se puede utilizar potencialmente en cualquier aplicación modificando la superficie SELDI. [1] SELDI-TOF-MS es óptimo para analizar proteínas de bajo peso molecular (<20 kDa) en una variedad de materiales biológicos, como muestras de tejido, sangre, orina y suero. Esta técnica se utiliza a menudo en combinación con inmunotransferencia e inmunohistoquímica como herramienta de diagnóstico para ayudar en la detección de biomarcadores de enfermedades, y también se ha aplicado al diagnóstico de cáncer y trastornos neurológicos. [8] [9] SELDI-TOF-MS se ha utilizado en el descubrimiento de biomarcadores para cánceres de pulmón , mama , hígado , colon , páncreas , vejiga , riñón , cuello uterino , ovario y próstata . [2] La tecnología SELDI se utiliza más ampliamente en el descubrimiento de biomarcadores para comparar los niveles de proteínas en muestras de suero de pacientes sanos y enfermos. [9] [10] [11] [12] Los estudios de suero permiten un enfoque mínimamente invasivo para el monitoreo de enfermedades en los pacientes y son útiles en la detección temprana y el diagnóstico de enfermedades y trastornos neurológicos, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y el Alzheimer. . [9] [10]
SELDI-TOF-MS también se puede usar en aplicaciones biológicas para detectar proteínas modificadas postraduccionalmente y para estudiar los estados de fosforilación de proteínas. [8]
Ventajas
Una de las principales ventajas del proceso SELDI es el paso de separación cromatográfica. Mientras que la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se basa en la elución de analitos en la muestra separada, la separación en SELDI se basa en la retención. Cualquier componente de la muestra que interfiera con las mediciones analíticas, como sales, detergentes y tampones, se elimina antes del análisis con espectrometría de masas. Solo se analizan los analitos que están unidos a la superficie, lo que reduce la complejidad general de la muestra. Como resultado, existe una mayor probabilidad de detectar analitos que están presentes en concentraciones más bajas. [10] Debido al paso de separación inicial, se pueden obtener perfiles de proteínas a partir de muestras de tan solo 25-50 células. [8]
En aplicaciones biológicas, SELDI-TOF-MS tiene la ventaja principal de que la técnica no requiere el uso de isótopos radiactivos. Además, se puede tomar una muestra de un ensayo en múltiples puntos de tiempo durante un experimento. [8] Además, en proteómica , los pasos de descubrimiento, identificación y validación de biomarcadores pueden realizarse en la superficie SELDI. [1]
Limitaciones
SELDI es a menudo criticado por su reproducibilidad debido a las diferencias en los espectros de masas obtenidos cuando se utilizan diferentes lotes de superficies de viruta. [2] Si bien el método ha tenido éxito en el análisis de proteínas de bajo peso molecular, no se han obtenido resultados consistentes al analizar proteínas de alto peso molecular. [8] También existe la posibilidad de sesgo de la muestra, ya que las matrices de absorción inespecíficas favorecen la unión de analitos con mayor abundancia en la muestra a expensas de analitos menos abundantes. [2] Si bien SELDI-TOF-MS tiene límites de detección en el rango femtomolar, [10] la señal de línea de base en los espectros varía y el ruido debido a la matriz es máximo por debajo de 2000 Da, y Ciphergen Biosystems sugiere ignorar los picos espectrales por debajo de 2000 Da . [13]
Ver también
Desorción láser suave
Referencias
- ↑ a b c d e f g h Tang N, Tornatore P, Weinberger SR (2004). "Desarrollos actuales en tecnología de afinidad SELDI". Revisiones de espectrometría de masas . 23 (1): 34–44. Código Bibliográfico : 2004MSRv ... 23 ... 34T . doi : 10.1002 / mas.10066 . PMID 14625891 .
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