El análisis de matriz genética sintética ( SGA ) es una técnica de alto rendimiento para explorar interacciones genéticas enfermas sintéticas letales y sintéticas ( SSL ). [1] SGA permite la construcción sistemática de mutantes dobles utilizando una combinación de técnicas genéticas recombinantes , pasos de apareamiento y selección. Utilizando la metodología SGA, un mutante de deleción de un gen de consulta se puede cruzar con un conjunto completo de deleción del genoma para identificar cualquier SSLinteracciones, produciendo información funcional del gen de la consulta y los genes con los que interactúa. Una aplicación a gran escala de SGA en la que se cruzaron ~ 130 genes de consulta con el conjunto de ~ 5000 mutantes de deleción viables en levadura reveló una red genética que contenía ~ 1000 genes y ~ 4000 interacciones SSL. [2] Los resultados de este estudio mostraron que los genes con funciones similares tienden a interactuar entre sí y los genes con patrones similares de interacciones genéticas a menudo codifican productos que tienden a trabajar en la misma vía o complejo. El análisis de matriz genética sintética se desarrolló inicialmente utilizando el organismo modelo S. cerevisiae . Desde entonces, este método se ha ampliado para cubrir el 30% del genoma de S. cerevisiae . [3]Desde entonces, se ha desarrollado una metodología para permitir el análisis SGA en S. pombe [4] [5] y E. coli . [6] [7]
Fondo
El análisis de matrices genéticas sintéticas fue desarrollado inicialmente por Tong et al. [1] en 2001 y desde entonces ha sido utilizado por muchos grupos que trabajan en una amplia gama de campos biomédicos. SGA utiliza el conjunto completo de eliminación del genoma de levadura creado por el proyecto de deleción del genoma de levadura. [8]
Procedimiento
El análisis de matrices genéticas sintéticas se realiza generalmente utilizando matrices de colonias en petriplates a densidades estándar (96, 384, 768, 1536). Para realizar un análisis SGA en S. cerevisae , la deleción del gen de consulta se cruza sistemáticamente con una matriz de deleción mutante (DMA) que contiene cada ORF knockout viable del genoma de levadura (actualmente 4786 cepas). [9] Los diploides resultantes luego se esporulan transfiriéndolos a un medio que contiene nitrógeno reducido. A continuación, la progenie haploide se somete a una serie de placas de selección e incubaciones para seleccionar mutantes dobles. Los mutantes dobles se examinan visualmente para detectar interacciones SSL o mediante software de imágenes evaluando el tamaño de las colonias resultantes.
Robótica
Debido a la gran cantidad de pasos de replicación precisos en el análisis SGA, los robots se utilizan ampliamente para realizar manipulaciones de colonias. Hay algunos sistemas diseñados específicamente para el análisis SGA, que reducen en gran medida el tiempo para analizar un gen de consulta. Generalmente, estos tienen una serie de clavijas que se utilizan para transferir células hacia y desde las placas, con un sistema que utiliza almohadillas desechables de clavijas para eliminar los ciclos de lavado. Se pueden utilizar programas informáticos para analizar el tamaño de las colonias a partir de imágenes de las placas, automatizando así la puntuación SGA y el perfil químico-genético.
Paso para un sistema de cribado genético de todo el genoma de alto contenido de levadura (mapa de carreteras de SGA)
Hay seis componentes principales
- Colección mutante
- Material y herramientas para el manejo de mutantes.
- Sistema de análisis de imágenes
- Sistema automático de cuantificación y puntuación.
- Se acerca la confirmación
- Herramientas de análisis de datos
- Colección mutante
El primer paso es recolectar los mutantes y crear una biblioteca de mutantes en medios sólidos o líquidos. Los medios sólidos podrían ser mejores porque podrían ahorrar mucho tiempo. En la etapa inicial, la creación de mutantes se realizó mediante el método de recombinación homóloga. Tenemos una excelente biblioteca de mutantes para Saccharomyces cerevisiae , un organismo modelo bien estudiado.
Sin embargo, si está probando un nuevo modelo de levadura, podría tener que realizar una secuenciación del genoma y predecir el posible ORF mediante el buen genoma de levadura de referencia (por ejemplo: con Saccharomyces cerevisiae). Considere un caso especial: si no tiene un genoma de referencia, debe realizar un análisis del transcriptoma y del genoma de ese nuevo organismo modelo.
- Material y herramientas para manejar los mutantes
Una vez que tenga su biblioteca de mutantes en medios sólidos. Si los mutantes están en medios sólidos, hemos dispuesto los mutantes con una ración de 1: 3, es decir, para una matriz de tipo salvaje a 3 mutantes (¿por qué? El tipo salvaje funciona como un control interno y en un medio sólido el nutriente no debe compartirse por igual para evitar parcialidad). Una vez que tenga mutantes con un solo gen eliminado, puede iniciar las herramientas para manejar los mutantes. En SGA se le llama "Fijación". Versiones de ROTOR-HAD (referidas como robot de fijación) utilizadas para fijar los mutantes de levadura. Esta máquina instalada con una interfaz fácil de usar que ayuda a fijar las muestras desde las placas de origen a las placas experimentales.
- Sistema de análisis de imágenes
- Sistema automático de cuantificación y puntuación.
- Se acerca la confirmación
- Herramientas de análisis de datos
Colección mutante
Ver también
Referencias
- ^ a b Tong, AHY; Evangelista, M .; Parsons, AB; Xu, H .; Bader, GD; Pagé, N .; Robinson, M .; Raghibizadeh, S .; Hogue, CW; Bussey, H .; Andrews, B .; Tyers, M .; Boone, C. (2001). "Análisis genético sistemático con matrices ordenadas de mutantes por deleción de levadura". Ciencia . 294 (5550): 2364–2368. doi : 10.1126 / science.1065810 . PMID 11743205 .
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- ^ " Proyecto de eliminación del genoma de Saccharomyces " .
- ^ "Cepas Knockout de levadura" . Abra Biosystems . Archivado desde el original el 19 de noviembre de 2011.