Proteasa TEV
La proteasa TEV ( EC 3.4.22.44 , inclusión nuclear del virus del grabado del tabaco-una endopeptidasa ) es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia del virus del grabado del tabaco (TEV). [1] Es un miembro del clan PA de proteasas similares a quimotripsina . [2] Debido a su alta especificidad de secuencia, se utiliza con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión in vitro e in vivo . [3]
El virus del grabado del tabaco codifica todo su genoma como una sola poliproteína masiva (350 kDa). Esta se escinde en unidades funcionales mediante las tres proteasas: proteasa P1 (1 sitio de escisión), proteasa de componente auxiliar (1 sitio de escisión) y proteasa TEV (7 sitios de escisión). [1] La proteasa TEV nativa también contiene un sitio de autoescisión interno. Este sitio se escinde lentamente para inactivar la enzima (se desconoce la razón fisiológica de esto).
La estructura de la proteasa TEV se ha resuelto por cristalografía de rayos X . [4] Está compuesto por dos barriles β y una cola C-terminal flexible y muestra homología estructural con la superfamilia de proteasas de quimotripsina ( clan PA , familia C4 según la clasificación MEROPS ). [2] Aunque es homóloga a las serina proteasas celulares (como tripsina , elastasa , trombina , etc.), la proteasa TEV utiliza una cisteína como nucleófilo catalítico [5] (al igual que muchas otras proteasas virales).
La catálisis covalente se realiza con una tríada Asp-His-Cys , dividida entre los dos barriles (Asp en β1 e His y Cys en β2). [6] El sustrato se mantiene como una hoja β, formando una interacción antiparalela con la hendidura entre los barriles y una interacción paralela con la cola C-terminal. [7] Por lo tanto, la enzima forma un túnel de unión alrededor del sustrato y las interacciones de la cadena lateral controlan la especificidad. [4]
La secuencia de escisión nativa preferida se identificó en primer lugar examinando los sitios de corte en el sustrato de poliproteína nativa para determinar la secuencia recurrente. El consenso para estos sitios de corte nativos es ENLYFQ \ S donde '\' indica el enlace peptídico escindido . [8] Los residuos del sustrato se etiquetan como P6 a P1 antes del sitio de corte y P1 'después del sitio de corte. Los primeros trabajos también midieron la escisión de una serie de sustratos similares para caracterizar qué tan específica era la proteasa para la secuencia nativa. [9] [10]
Posteriormente, los estudios han utilizado la secuenciación de sustratos escindidos de un conjunto de secuencias aleatorias para determinar patrones de preferencia. [11] [12] Aunque ENLYFQ \ S es la secuencia óptima, la proteasa es activa en mayor o menor medida en una variedad de sustratos (es decir, muestra cierta promiscuidad de sustrato ). La escisión más alta es la de secuencias más cercanas al consenso EXLYΦQ \ φ donde X es cualquier residuo, Φ es cualquier residuo hidrófobo grande o mediano y φ es cualquier residuo hidrófobo o polar pequeño. Aunque esta secuencia es la óptima, las secuencias con residuos desfavorecidos en algunas posiciones aún se pueden escindir si el resto de la secuencia es óptima. [10] [12]
