La secuenciación por inserción de transposones ( Tn-seq ) combina la mutagénesis por inserción de transposones con la secuenciación paralela masiva (MPS) de los sitios de inserción de transposones para identificar genes que contribuyen a una función de interés en las bacterias . El método se estableció originalmente por el trabajo simultáneo en cuatro laboratorios bajo las siglas HITS, [1] INSeq, [2] TraDIS, [3] y Tn-Seq. [4] Numerosas variaciones se han desarrollado y aplicado posteriormente a diversos sistemas biológicos. En conjunto, los métodos a menudo se denominan Tn-Seq, ya que todos implican monitorear la aptitud de los mutantes de inserción de transposones a través de enfoques de secuenciación de ADN.[5]
Los transposones son segmentos de ADN discretos altamente regulados que pueden reubicarse dentro del genoma. Son universales y se encuentran en Eubacteria , Archaea y Eukarya , incluidos los humanos. Los transposones tienen una gran influencia en la expresión génica y pueden usarse para determinar la función génica. De hecho, cuando un transposón se inserta en un gen, la función del gen se verá interrumpida. [6] Debido a esa propiedad, los transposones han sido manipulados para su uso en la mutagénesis por inserción. [7] El desarrollo de la secuenciación del genoma microbiano fue un gran avance para el uso de la mutagénesis de transposones. [8] [9]La función afectada por la inserción de un transposón podría vincularse al gen interrumpido mediante la secuenciación del genoma para localizar el sitio de inserción del transposón. La secuenciación paralela masiva permite la secuenciación simultánea de sitios de inserción de transposones en grandes mezclas de diferentes mutantes. Por lo tanto, el análisis de todo el genoma es factible si los transposones se colocan en todo el genoma en una colección de mutantes. [5]
La secuenciación de transposones requiere la creación de una biblioteca de inserción de transposones, que contendrá un grupo de mutantes que colectivamente tienen inserciones de transposones en todos los genes no esenciales. La biblioteca se cultiva bajo una condición experimental de interés. Los mutantes con transposones insertados en los genes necesarios para el crecimiento en las condiciones de prueba disminuirán en frecuencia en la población. Para identificar los mutantes que se pierden, las secuencias genómicas adyacentes a los extremos del transposón se amplifican mediante PCR .y secuenciado por MPS para determinar la ubicación y abundancia de cada mutación de inserción. La importancia de cada gen para el crecimiento en las condiciones de prueba se determina comparando la abundancia de cada mutante antes y después del crecimiento en las condiciones que se examinan. Tn-seq es útil tanto para el estudio de la aptitud de un solo gen como para las interacciones entre genes [10]
La mutagénesis marcada con firma (STM) es una técnica más antigua que también implica la combinación de mutantes de inserción de transposones para determinar la importancia de los genes interrumpidos en condiciones de crecimiento selectivo. [11] Las versiones de alto rendimiento de STM utilizan micromatrices genómicas, que son menos precisas y tienen un rango dinámico más bajo que la secuenciación paralela masiva. [5] Con la invención de la secuenciación de próxima generación, los datos genómicos estuvieron cada vez más disponibles. Sin embargo, a pesar del aumento de los datos genómicos, nuestro conocimiento de la función de los genes sigue siendo el factor limitante en nuestra comprensión del papel que desempeñan los genes. [12] [13] Por lo tanto, era necesario un enfoque de alto rendimiento para estudiar las relaciones genotipo-fenotipo como Tn-seq.
La secuenciación de transposones comienza con la transducción [ aclaración necesaria ] de poblaciones bacterianas con elementos transponibles [ aclaración necesaria ] utilizando bacteriófagos . Tn-seq [ aclaración necesaria ] utiliza el transposón Himar I Mariner, un transposón común y estable [ aclaración necesaria ] . Después de la transducción, el ADN se escinde [ se necesita aclaración ] y la secuencia insertada se amplifica mediante PCR . Los sitios de reconocimiento [ aclaración necesaria ] para MmeI, una endonucleasa de restricción de tipo IIS[ aclaración necesaria ] , puede ser introducido por un solo cambio de nucleótido en las repeticiones terminales [ aclaración necesaria ] de Mariner [ aclaración necesaria ] . [14] Se [ aclaración necesaria ] se encuentra 4 pares de bases antes del final de la repetición terminal.