La mutagénesis de transposones , o mutagénesis de transposición , es un proceso biológico que permite que los genes se transfieran al cromosoma de un organismo huésped , interrumpiendo o modificando la función de un gen existente en el cromosoma y provocando una mutación . [1] La mutagénesis de transposones es mucho más eficaz que la mutagénesis química , con una frecuencia de mutación más alta y una menor probabilidad de matar al organismo. Otras ventajas incluyen poder inducir mutaciones de un solo golpe, poder incorporar marcadores seleccionables en la construcción de cepas y poder recuperar genes después de la mutagénesis. [2] Las desventajas incluyen la baja frecuencia de transposición en los sistemas vivos y la inexactitud de la mayoría de los sistemas de transposición.
Historia
La mutagénesis de transposones fue estudiada por primera vez por Barbara McClintock a mediados del siglo XX durante su trabajo ganador del Premio Nobel con el maíz. McClintock recibió su licenciatura en 1923 de la Facultad de Agricultura de Cornell. En 1927 obtuvo su doctorado en botánica e inmediatamente comenzó a trabajar en el tema de los cromosomas del maíz . [3] A principios de la década de 1940, McClintock estaba estudiando la progenie de plantas de maíz autopolinizadas que resultaron de cruces con un cromosoma 9 roto. A estas plantas les faltaban los telómeros . Esta investigación impulsó el primer descubrimiento de un elemento transponible , [4] y desde allí se ha explotado la mutagénesis de transposones como herramienta biológica.
Dinámica
En el caso de las bacterias , la mutagénesis por transposición se realiza habitualmente mediante un plásmido del que se extrae un transposón y se inserta en el cromosoma del huésped. Esto generalmente requiere que se traduzca un conjunto de enzimas, incluida la transposasa . La transposasa se puede expresar en un plásmido separado o en el plásmido que contiene el gen que se va a integrar. Alternativamente, una inyección de ARNm de transposasa en la célula huésped puede inducir la traducción y expresión . [5] Los primeros experimentos de mutagénesis de transposones se basaron en bacteriófagos y plásmidos bacterianos conjugativos para la inserción de secuencias. Estos eran muy inespecíficos y dificultaban la incorporación de genes específicos. Una técnica más nueva llamada mutagénesis lanzadera utiliza genes clonados específicos de la especie huésped para incorporar elementos genéticos. [2] Otro método eficaz es administrar transposones a través de cápsides virales . Esto facilita la integración en el cromosoma y la expresión transgénica a largo plazo . [5]
Sistema de transposón tn5
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/c/cf/Tn5_gene_diagram.png/220px-Tn5_gene_diagram.png)
El sistema de transposones Tn5 es un sistema modelo para el estudio de la transposición y para la aplicación de mutagénesis de transposones. Tn5 es un transposón compuesto bacteriano en el que los genes (el sistema original que contiene genes de resistencia a antibióticos ) están flanqueados por dos secuencias de inserción casi idénticas , denominadas IS50R e IS50L correspondientes a los lados derecho e izquierdo del transposón respectivamente. [6] La secuencia IS50R codifica dos proteínas, Tnp e Inh. Estas dos proteínas son idénticas en secuencia, salvo por el hecho de que Inh carece de los 55 aminoácidos N-terminales . Tnp codifica una transposasa para todo el sistema e Inh codifica un inhibidor de la transposasa. El dominio de unión al ADN de Tnp reside en los 55 aminoácidos N-terminales, por lo que estos residuos son esenciales para su función. [6] Las secuencias IS50R e IS50L están flanqueadas por elementos de 19 pares de bases en los extremos interior y exterior del transposón, denominados IE y OE respectivamente. La mutación de estas regiones da como resultado una incapacidad de los genes de transposasa para unirse a las secuencias. Las interacciones de unión entre la transposasa y estas secuencias son muy complicadas y se ven afectadas por la metilación del ADN y otras marcas epigenéticas . [6] Además, otras proteínas parecen ser capaces de unirse y afectar la transposición de los elementos IS50, como el DnaA.
La vía más probable de transposición de Tn 5 es la vía común para todos los sistemas de transposones. Comienza con la unión de Tnp a las secuencias OE e IE de cada secuencia IS50. Los dos extremos se juntan y, a través de la oligomerización del ADN, la secuencia se corta del cromosoma. Después de introducir los extremos 5 'del par de bases 9 en el ADN diana, el transposón y sus genes incorporados se insertan en el ADN diana, duplicando las regiones en cada extremo del transposón. [6] Los genes de interés pueden modificarse mediante ingeniería genética en el sistema de transposones entre las secuencias IS50. Al colocar el transposón bajo el control de un promotor del huésped , los genes se expresarán. Los genes incorporados normalmente incluyen, además del gen de interés, un marcador seleccionable para identificar transformantes, un promotor / terminador eucariota (si se expresa en un eucariota) y secuencias 3 ' UTR para separar genes en un tramo policistrónico de secuencia.
Sistema de transposones de la Bella Durmiente
El sistema de transposones de la Bella Durmiente (SBTS) es el primer vector no viral exitoso para la incorporación de un casete de genes en un genoma de vertebrados . Hasta el desarrollo de este sistema, los principales problemas de la terapia génica no viral han sido la degradación intracelular del transgén debido a que se reconoce como procariotas y la entrega ineficaz del transgén a los sistemas de órganos. El SBTS revolucionó estos problemas al combinar las ventajas de los virus y el ADN desnudo. Consiste en un transposón que contiene el casete de genes a expresar, así como su propia enzima transposasa. Transponiendo el casete directamente al genoma del organismo desde el plásmido, se puede lograr la expresión sostenida del transgén. [2] Esto se puede refinar aún más mejorando las secuencias de transposones y las enzimas transposasas utilizadas. SB100X es una transposasa de mamífero hiperactiva que es aproximadamente 100 veces más eficiente que la transposasa típica de primera generación. La incorporación de esta enzima en el casete da como resultado una expresión transgénica aún más sostenida (durante un año). Además, las frecuencias de transgénesis pueden llegar hasta el 45% cuando se usa inyección pronuclear en cigotos de ratón . [7]
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/f/f8/SBTS.png/220px-SBTS.png)
El mecanismo del SBTS es similar al sistema de transposones Tn5, sin embargo, las secuencias de la enzima y el gen son de naturaleza eucariota en contraposición a las procariotas. La tranposasa del sistema puede actuar tanto en trans como en cis , lo que permite una colección diversa de estructuras de transposones. El transposón en sí está flanqueado por secuencias repetidas invertidas , cada una de las cuales se repite dos veces de forma directa, denominadas secuencias IR / DR. La región interna consiste en el gen o secuencia que se va a transponer y también podría contener el gen de la transposasa. Alternativamente, la transposasa puede codificarse en un plásmido separado o inyectarse en su forma de proteína. Otro enfoque más consiste en incorporar tanto los genes del transposón como de la transposasa en un vector viral, que puede dirigirse a una célula o tejido de elección. La proteína transposasa es extremadamente específica en las secuencias a las que se une y es capaz de distinguir sus secuencias IR / DR de una secuencia similar por tres pares de bases. Una vez que la enzima se une a ambos extremos del transposón, las secuencias IR / DR se unen y la transposasa las mantiene en una Formación de Complejo Sináptico (SCF). La formación de SCF es un punto de control que garantiza una escisión adecuada. HMGB1 es una proteína no histona del huésped que está asociada con la cromatina eucariota. Mejora la unión preferencial de la transposasa a las secuencias IR / DR y probablemente sea esencial para la formación / estabilidad del complejo SCF. La transposasa escinde el ADN en los sitios objetivo, generando proyecciones 3 ' . Luego, la enzima se dirige a los dinucleótidos TA en el genoma del huésped como sitios de destino para la integración. El mismo sitio catalítico enzimático que escindió el ADN es responsable de integrar el ADN en el genoma, duplicando la región del genoma en el proceso. Aunque la transposasa es específica para los dinucleótidos TA, la alta frecuencia de estos pares en el genoma indica que el transposón experimenta una integración bastante aleatoria. [8]
Aplicaciones prácticas
Como resultado de la capacidad de la mutagénesis de transposones para incorporar genes en la mayoría de las áreas de los cromosomas diana, hay una serie de funciones asociadas con el proceso.
- Los genes de virulencia en virus y bacterias se pueden descubrir alterando los genes y observando un cambio en el fenotipo . Esto tiene importancia en la producción de antibióticos y el control de enfermedades. [4]
- Los genes no esenciales pueden descubrirse induciendo mutagénesis de transposones en un organismo. A continuación, los genes transformados pueden identificarse mediante la realización de PCR en el genoma recuperado del organismo utilizando un cebador específico de ORF y un cebador específico de transposón. [4] Dado que los transposones pueden incorporarse en regiones no codificantes de ADN, el cebador específico de ORF asegura que el transposón interrumpió un gen. Debido a que el organismo sobrevivió después de la integración homóloga , el gen interrumpido claramente no era esencial.
- Los genes que causan cáncer se pueden identificar mediante mutagénesis en todo el genoma y detección de mutantes que contienen tumores. Según el mecanismo y los resultados de la mutación, los genes causantes de cáncer pueden identificarse como oncogenes o genes supresores de tumores . [9]
Ejemplos específicos
Identificación del grupo de genes de virulencia de Mycobacterium tuberculosis
En 1999, los genes de virulencia asociados con Mycobacterium tuberculosis se identificaron mediante la eliminación de genes mediada por mutagénesis de transposones . Se diseñó un plásmido denominado pCG113 que contenía genes de resistencia a kanamicina y la secuencia de inserción IS 1096 para contener etiquetas variables de 80 pares de bases. A continuación, los plásmidos se transformaron en células de M. tuberculosis mediante electroporación . Las colonias se sembraron en kanamicina para seleccionar células resistentes. Las colonias que experimentaron eventos de transposición aleatoria se identificaron mediante digestión con Bam HI y transferencia de Southern utilizando una sonda de ADN IS 1096 interna . Las colonias se cribaron en busca de multiplicación atenuada para identificar colonias con mutaciones en genes de virulencia candidatos. Las mutaciones que conducen a un fenotipo atenuado se mapearon mediante amplificación de regiones adyacentes a las secuencias de IS 1096 y se compararon con el genoma publicado de M. tuberculosis . En este caso, la mutagénesis de transposones identificó 13 loci patógenos en el genoma de M. tuberculosis que no estaban asociados previamente con la enfermedad. [10] Ésta es información esencial para comprender el ciclo infeccioso de la bacteria.
Mutagénesis del transposón PiggyBac (PB) para el descubrimiento del gen del cáncer
El transposón PiggyBac (PB) de la polilla de la col, Trichoplusia ni, fue diseñado para ser altamente activo en células de mamíferos y es capaz de mutagénesis en todo el genoma. Los transposones contenían repeticiones invertidas tanto de PB como de La Bella Durmiente , para ser reconocidos por ambas transposasas y aumentar la frecuencia de transposición. Además, el transposón contenía elementos promotores y potenciadores , un donante de empalme y aceptores para permitir mutaciones de ganancia o pérdida de función dependiendo de la orientación del transposón y señales de poliadenilación bidireccional . Los transposones se transformaron en células de ratón in vitro y se analizaron los mutantes que contenían tumores. El mecanismo de la mutación que conduce a la formación de un tumor determina si el gen se clasifica como un oncogén o un gen supresor de tumores. Los oncogenes tendían a caracterizarse por inserciones en regiones que conducían a la sobreexpresión de un gen, mientras que los genes supresores de tumores se clasificaban como tales basándose en mutaciones de pérdida de función. Dado que el ratón es un organismo modelo para el estudio de la fisiología y la enfermedad humanas, esta investigación ayudará a comprender mejor los genes que causan el cáncer y las posibles dianas terapéuticas. [9]
Ver también
- Los transposones como herramienta genética
- Elemento transportable
- Transposasa
- Barbara McClintock
Referencias
- ^ "Alimentando bocas hambrientas" . Programa de biotecnología: Informes de proyectos: Análisis del genoma . Comisión Europea. 2001. 2-2.
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enlaces externos
- "Saltar genes: del fenómeno a la herramienta" . Ingeniería genética: Plantas: Medio ambiente . GMO-Safety.eu. 21 de abril de 2006.
- "Transposon Mutagenisis" - Noticias sobre ingredientes alimentarios
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