La lisis alcalina o extracción alcalina es un método utilizado en biología molecular para aislar ADN plasmídico de bacterias.
Primero se cultivan las bacterias que contienen el plásmido de interés , luego se centrifuga una muestra para concentrar el material celular (incluido el ADN ) en un sedimento en el fondo del recipiente contenedor. El sobrenadante se desecha y el sedimento se vuelve a suspender en un tampón fisiológico que contiene EDTA . El propósito del EDTA es quelar cationes de metales divalentes como Mg 2+ y Ca 2+ , que son necesarios para la función de las enzimas que degradan el ADN ( ADNasas ).) y también sirven para desestabilizar el esqueleto de fosfato del ADN y la pared celular. La glucosa en el tampón mantendrá la presión osmótica de la célula para evitar que estalle. Tris en el tampón retendrá el pH de la célula con 8,0 y la RNasa eliminará el ARN, lo que interrumpirá el experimento.
Por separado, se prepara y luego se agrega una solución alcalina fuerte que consta del detergente dodecilsulfato de sodio (SDS) y una base fuerte como hidróxido de sodio (NaOH). La mezcla resultante se incuba durante unos minutos. Durante este tiempo, el detergente rompe las membranas celulares y permite que el álcali entre en contacto y desnaturalice tanto el ADN cromosómico como el plásmido. Después de romper la membrana celular mediante SDS, el contenido celular neutralizará el NaOH; por eso el pH de la lisis baja de 12,8 a 12,3. Entonces, si no hay suficientes células bacterianas, el NaOH adicional funcionará para generar pequeños fragmentos de ADN. Pero la L-arginina 0,5 M, que puede proporcionar un pH estable, se puede usar para reemplazar el hidróxido de sodio 0,1 M. [1]
Finalmente, se agrega acetato de potasio . Esto acidifica la solución y permite la renaturalización del ADN plasmídico, pero no del ADN cromosómico, que se precipita fuera de la solución. Otra función del potasio es provocar la precipitación del dodecilsulfato de sodio y, por lo tanto, la eliminación del detergente. Se lleva a cabo una centrifugación final y, esta vez, el sedimento solo contiene residuos y se puede desechar. El sobrenadante que contiene el plásmido se elimina con cuidado y se puede purificar o utilizar para análisis, como la electroforesis en gel .
Además, a veces se utiliza la lisis alcalina para extraer material genético vegetal. Las células vegetales se someten a una solución fuertemente alcalina que contiene un detergente (generalmente un detergente zwitteriónico o no iónico como Tween 20 ), y la mezcla se incuba a alta temperatura. Este método no se usa con tanta frecuencia debido a la tendencia del hidróxido de sodio a dañar el material genético, reduciendo el tamaño de los fragmentos de ADN.