Una preparación de plásmido es un método de extracción de ADN y purificación de ADN plasmídico . Se han desarrollado muchos métodos para purificar el ADN plasmídico de bacterias . Estos métodos invariablemente implican tres pasos: [1]
- Crecimiento del cultivo bacteriano
- Recolección y lisis de las bacterias.
- Purificación de ADN plasmídico
Crecimiento del cultivo bacteriano
Los plásmidos casi siempre se purifican a partir de cultivos de bacterias líquidas , generalmente E. coli , que se han transformado y aislado. Prácticamente todos los vectores plasmídicos de uso común codifican uno o más genes de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable , por ejemplo, un gen que codifica la resistencia a ampicilina o kanamicina, que permite que las bacterias que se han transformado con éxito se multipliquen sin inhibiciones. Se supone que las bacterias que no han absorbido el vector plasmídico carecen del gen de resistencia y, por tanto, sólo se espera que crezcan las colonias que representan transformaciones satisfactorias. Las bacterias se cultivan en condiciones favorables.
Recolección y lisis de las bacterias.
Cuando las bacterias se lisan en condiciones alcalinas (pH 12,0-12,5), tanto el ADN cromosómico como la proteína se desnaturalizan; sin embargo, el ADN plasmídico permanece estable. Algunos científicos reducen la concentración de NaOH utilizada a 0,1 M para reducir la aparición de ssDNA . Después de la adición de tampón de neutralización que contiene acetato, el ADN cromosómico y las proteínas grandes y menos superenrollados precipitan, pero los pequeños plásmidos de ADN bacteriano permanecen en solución.
Preparaciones por tamaño
Los kits están disponibles de diferentes fabricantes para purificar el ADN plasmídico, que se denominan según el tamaño del cultivo bacteriano y el rendimiento de plásmido correspondiente. En orden creciente, estos son miniprep, midiprep, maxiprep, megaprep y gigaprep. El rendimiento del ADN plasmídico variará según el número de copias del plásmido, el tipo y el tamaño, la cepa bacteriana, las condiciones de crecimiento y el kit.
Minipreparación
La minipreparación de ADN plasmídico es un aislamiento rápido y a pequeña escala de ADN plasmídico de bacterias . Se basa en el método de lisis alcalina . El ADN plasmídico extraído resultante de la realización de una minipreparación se denomina a menudo "minipreparación". Las minipreparaciones se utilizan en el proceso de clonación molecular para analizar clones bacterianos . Un rendimiento típico de ADN plasmídico de una minipreparación es de 5 a 50 µg dependiendo de la cepa celular. La minipreparación de un gran número de plásmidos también se puede realizar convenientemente en papel de filtro lisando la célula y eluyendo el plásmido sobre papel de filtro.
Midipreparation
El volumen de cultivo inicial de E. coli es de 15 a 25 ml de caldo de lisogenia (LB) y el rendimiento de ADN esperado es de 100 a 350 µg.
Maxipreparación
El volumen de cultivo inicial de E. coli es de 100 a 200 ml de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 500 a 850 µg.
Megapreparación
El volumen de cultivo de E. coli inicial es de 500 ml - 2,5 L de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 1,5-2,5 mg.
Gigapreparación
El volumen de cultivo inicial de E. coli es de 2,5 a 5 L de LB y el rendimiento esperado de ADN es de 7,5 a 10 mg.
Purificación de ADN plasmídico
Existen múltiples métodos de purificación de ácidos nucleicos. Todos funcionan según el principio de generar condiciones en las que solo precipita el ácido nucleico o solo precipitan otras biomoléculas , lo que permite que el ácido nucleico se separe.
Precipitación de etanol
La precipitación con etanol funciona mediante el uso de etanol como antidisolvente del ADN, lo que hace que se precipite de la solución. La fracción soluble se descarta para eliminar otras biomoléculas.
Columna de giro
La purificación de ácido nucleico basada en columna de centrifugación precipita el ácido nucleico de manera que se une a una matriz sólida y otros componentes fluyen a través de ella. A continuación, se cambian las condiciones para eluir el ácido nucleico purificado.
Extracción de fenol-cloroformo
En una extracción con fenol-cloroformo , la adición de una mezcla de fenol / cloroformo disolverá los contaminantes de proteínas y lípidos, dejando los ácidos nucleicos en la fase acuosa. También desnaturaliza proteínas, como la DNasa , que es especialmente importante si los plásmidos se van a utilizar para la digestión enzimática . De lo contrario, pueden producirse manchas en forma de ADN plasmídico restringido por enzimas.
Referencias
- ^ Bouchard, Roland; et al. (2010). Métodos de laboratorio en microbiología . Universal Scientific. págs. 119-126.
Otras lecturas
- Birnboim HC, Doly J (noviembre de 1979). "Un procedimiento de extracción alcalina rápida para la detección de ADN plasmídico recombinante" . Investigación de ácidos nucleicos . 7 (6): 1513–23. doi : 10.1093 / nar / 7.6.1513 . PMC 342324 . PMID 388356 .
enlaces externos
- http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Plasmid/Miniprep/
- Un procedimiento de minipreparación que utiliza tierra de diatomeas para unir el ADN durante la purificación y el lavado.