Electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel utilizado en bioquímica , biología molecular , genética y química clínica para separar una población mixta de macromoléculas como ADN o proteínas en una matriz de agarosa , uno de los dos componentes principales del agar . Las proteínas se pueden separar por carga y / o tamaño (la electroforesis de agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño), y los fragmentos de ADN y ARN por longitud. [1] Las biomoléculas se separan aplicando un campo eléctrico.para mover las moléculas cargadas a través de una matriz de agarosa, y las biomoléculas se separan por tamaño en la matriz de gel de agarosa. [2]

Imagen digital de 3 digestiones de restricción de plásmido realizadas en un gel de agarosa al 1% p / v, 3 voltios / cm, teñido con bromuro de etidio. El marcador de tamaño de ADN es una escalera comercial de 1 kpb. Se anota la posición de los pozos y la dirección de la migración del ADN.

El gel de agarosa es fácil de moldear, tiene relativamente menos grupos cargados y es particularmente adecuado para separar ADN del rango de tamaño que se encuentra con mayor frecuencia en los laboratorios, lo que explica la popularidad de su uso. El ADN separado se puede ver con tinción, más comúnmente bajo luz ultravioleta, y los fragmentos de ADN se pueden extraer del gel con relativa facilidad. La mayoría de los geles de agarosa utilizados están disueltos entre un 0,7 y un 2% en un tampón de electroforesis adecuado.

Un gel de agarosa moldeado en bandeja, para ser utilizado para electroforesis en gel.

El gel de agarosa es una matriz tridimensional formada por moléculas de agarosa helicoidales en haces superenrollados que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. [3] La estructura 3-D se mantiene unida con enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentando de nuevo a un estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura de gelificación, dependiendo de las fuentes, el gel de agarosa tiene una temperatura de gelificación de 35 a 42 ° C y una temperatura de fusión de 85 a 95 ° C. También se encuentran disponibles agarosas de bajo punto de fusión y de baja gelificación obtenidas mediante modificaciones químicas.

El gel de agarosa tiene un tamaño de poro grande y una buena fuerza de gel, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. El tamaño de poro de un gel al 1% se ha estimado entre 100 nm y 200-500 nm, [4] [5] y su fuerza de gel permite que los geles diluidos al 0,15% formen una placa para la electroforesis en gel. [6] Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son frágiles y, por lo tanto, difíciles de manipular. El gel de agarosa tiene un poder de resolución más bajo que el gel de poliacrilamida para el ADN, pero tiene un mayor rango de separación y, por lo tanto, se usa para fragmentos de ADN de 50 a 20 000 pb de tamaño. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb, pero es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [7] También se puede utilizar para separar proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros lo suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4 . [6]

El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato . [8] Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en la dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO) y, por lo tanto, pueden retardar el movimiento del ADN y causar la distorsión de las bandas. Los geles de mayor concentración tendrían un mayor flujo electroendosmótico. Por lo tanto, se prefiere generalmente la agarosa de EEO baja para su uso en la electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa , pero la agarosa de EEO alta puede usarse para otros fines. El menor contenido de sulfato de la agarosa de bajo EEO, particularmente la agarosa de bajo punto de fusión (LMP), también es beneficioso en los casos en que el ADN extraído del gel se va a utilizar para una manipulación adicional, ya que la presencia de sulfatos contaminantes puede afectar algunos procedimientos posteriores, como como ligadura y PCR . Sin embargo, las agarosas con cero EEO no son deseables para algunas aplicaciones, ya que pueden prepararse agregando grupos cargados positivamente y tales grupos pueden afectar las reacciones enzimáticas posteriores. [9] La electroendosmosis es una razón por la que la agarosa se usa con preferencia al agar, ya que el componente de agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos carboxilo y sulfato cargados negativamente. La eliminación de agaropectina en agarosa reduce sustancialmente la EEO, además de reducir la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones tales como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable una EEO alta y se puede añadir agaropectina en el gel utilizado. [10]

Factores que afectan la migración de ácido nucleico en gel

Los geles de las preparaciones de plásmidos suelen mostrar una banda principal de ADN superenrollado con otras bandas más débiles en el mismo carril. Tenga en cuenta que, por convención, el gel de ADN se muestra con fragmentos de ADN más pequeños más cerca de la parte inferior del gel. Esto se debe a que, históricamente, los geles de ADN se corrían verticalmente y los fragmentos de ADN más pequeños se mueven hacia abajo más rápido.

Varios factores pueden afectar la migración de ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel (concentración del gel), el tamaño del ADN que se somete a electroforesis, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración de colorante intercalante como el bromuro de etidio. si se usa durante la electroforesis. [11]

Las moléculas más pequeñas viajan más rápido que las moléculas más grandes en gel, y el ADN de doble hebra se mueve a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes, y la separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere el uso de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corriente alterna desde dos direcciones diferentes y los fragmentos de ADN grandes se separan a medida que se reorientan con la corriente cambiante. [12]

Para la electroforesis en gel de agarosa estándar, las moléculas más grandes se resuelven mejor usando un gel de baja concentración, mientras que las moléculas más pequeñas se separan mejor en un gel de alta concentración. Sin embargo, el gel de altas concentraciones requiere tiempos de ejecución más largos (a veces días).

El movimiento del ADN puede verse afectado por la conformación de la molécula de ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado generalmente se mueve más rápido que el ADN relajado porque está estrechamente enrollado y, por lo tanto, más compacto. En una preparación de ADN plasmídico normal, pueden estar presentes múltiples formas de ADN. [13] La electroforesis en gel de los plásmidos normalmente mostraría la forma superenrollada negativamente como la banda principal, mientras que el ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada aparecen como bandas menores. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las diversas formas puede cambiar utilizando diferentes condiciones de electroforesis, [14] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que el ADN lineal por el tamaño de los poros del gel. [15]

El bromuro de etidio que se intercala en ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia en el gel durante la electroforesis puede afectar su movimiento. Por ejemplo, la carga positiva de bromuro de etidio puede reducir el movimiento del ADN en un 15%. [12] La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver ADN circular con diferentes topologías de superenrollamiento. [dieciséis]

El daño del ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración del ADN electroforético de una manera dependiente de la dosis. [17] [18]

La tasa de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, la resolución de grandes fragmentos de ADN es menor a alto voltaje. La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable; en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente en una frecuencia de ciclo particular. [4] Este fenómeno puede resultar en una inversión de banda en la electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE), por la cual los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños.

Anomalías de migración

  • Geles "sonrientes": este efecto de borde se produce cuando el voltaje aplicado es demasiado alto para la concentración de gel utilizada. [19]
  • Sobrecarga de ADN: la sobrecarga de ADN ralentiza la migración de fragmentos de ADN.
  • Contaminación: la presencia de impurezas, como sales o proteínas, puede afectar el movimiento del ADN.

Mecanismo de migración y separación

La carga negativa de su cadena principal de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis. [4] [20] Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, y existen varios modelos para explicar el mecanismo de separación de biomoléculas en la matriz de gel. Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz polimérica como un tamiz. Una proteína globular o un ADN en espiral aleatorio se mueve a través de los poros interconectados, y es más probable que el movimiento de moléculas más grandes se vea obstaculizado y ralentizado por las colisiones con la matriz del gel, por lo que las moléculas de diferentes tamaños se pueden separar en este proceso de tamizado. . [4]

Sin embargo, el modelo de Ogston se descompone para moléculas grandes, por lo que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, se utiliza con mayor frecuencia un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo asume que el ADN puede arrastrarse en forma de "serpiente" (de ahí "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Un modelo de reptación sesgado se aplica a una mayor intensidad de campo eléctrico, por lo que el extremo delantero de la molécula se polariza fuertemente en la dirección de avance y tira del resto de la molécula. [21] La microscopía de fluorescencia en tiempo real de moléculas teñidas, sin embargo, mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, con el ADN mostrando una elasticidad considerable al estirarse alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego contraerse en una bola, o engancharse en un Forma de U cuando queda atrapado en las fibras de polímero. [22] [23]

Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría sigue un procedimiento general.

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Video que muestra el montaje del equipo y la carga / funcionamiento del gel.

Fundición de gel

Carga de muestras de ADN en los pocillos de un gel de agarosa con una pipeta multicanal.

El gel se prepara disolviendo el polvo de agarosa en un tampón apropiado, como TAE o TBE, para su uso en electroforesis. [12] La agarosa se dispersa en el tampón antes de calentarla hasta casi el punto de ebullición, pero evite que hierva. Se deja que la agarosa derretida se enfríe lo suficiente antes de verter la solución en un molde, ya que el yeso puede deformarse o agrietarse si la solución de agarosa está demasiado caliente. Se coloca un peine en el yeso para crear pozos para cargar la muestra, y el gel debe estar completamente fraguado antes de su uso.

La concentración de gel afecta la resolución de la separación del ADN. El gel de agarosa se compone de poros microscópicos a través de los cuales viajan las moléculas, y existe una relación inversa entre el tamaño de los poros del gel de agarosa y la concentración: el tamaño de los poros disminuye a medida que aumenta la densidad de las fibras de agarosa. La alta concentración de gel mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que la reducción de la concentración de gel permite separar moléculas de ADN grandes. El proceso permite separar fragmentos que van desde 50 pares de bases hasta varias mega bases dependiendo de la concentración de gel utilizada. [24] La concentración se mide en peso de agarosa sobre el volumen de tampón utilizado (g / ml). Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, un gel al 0,8% proporciona una buena separación o resolución de fragmentos de ADN grandes de 5 a 10 kb, mientras que un gel al 2% proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb. Los geles al 1% se utilizan a menudo para una electroforesis estándar. [25] Los geles de alto porcentaje son a menudo frágiles y pueden no fraguar uniformemente, mientras que los geles de bajo porcentaje (0,1-0,2%) son frágiles y no fáciles de manipular. Los geles de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) también son más frágiles que el gel de agarosa normal. La agarosa de bajo punto de fusión puede usarse sola o simultáneamente con agarosa estándar para la separación y aislamiento del ADN. [26] PFGE y FIGE a menudo se realizan con geles de agarosa de alto porcentaje.

Carga de muestras

Una vez que el gel se ha asentado, se retira el peine, dejando pozos donde se pueden cargar las muestras de ADN. El tampón de carga se mezcla con la muestra de ADN antes de cargar la mezcla en los pocillos. El tampón de carga contiene un compuesto denso, que puede ser glicerol, sacarosa o Ficoll , que aumenta la densidad de la muestra para que la muestra de ADN se hunda hasta el fondo del pozo. [12] Si la muestra de ADN contiene etanol residual después de su preparación, puede flotar fuera del pozo. El tampón de carga también incluye tintes de color como xileno cianol y azul de bromofenol que se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis. Las muestras de ADN se cargan con una pipeta .

Electroforesis

Placa de gel de agarosa en tanque de electroforesis con bandas de colorantes que indican el progreso de la electroforesis. El ADN se mueve hacia el ánodo.

La electroforesis en gel de agarosa se realiza con mayor frecuencia de forma horizontal en un modo submarino en el que el gel de losa se sumerge completamente en tampón durante la electroforesis. También es posible, pero menos común, realizar la electroforesis verticalmente, así como horizontalmente con el gel levantado sobre patas de agarosa usando un aparato apropiado. [27] El tampón utilizado en el gel es el mismo que el tampón de funcionamiento en el tanque de electroforesis, por lo que la electroforesis en el modo submarino es posible con gel de agarosa.

Para una resolución óptima de ADN de más de 2  kb de tamaño en electroforesis en gel estándar, se recomienda de 5 a 8 V / cm (la distancia en cm se refiere a la distancia entre electrodos, por lo tanto, este voltaje recomendado sería de 5 a 8 multiplicado por la distancia entre los electrodos en cm). [14] El voltaje también puede estar limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se hace funcionar a alto voltaje durante un período prolongado, especialmente si el gel utilizado es gel de agarosa LMP. Un voltaje demasiado alto también puede reducir la resolución, además de causar rayas en las bandas de las moléculas de ADN grandes. Un voltaje demasiado bajo puede provocar el ensanchamiento de la banda para pequeños fragmentos de ADN debido a la dispersión y difusión. [28]

Dado que el ADN no es visible a la luz natural, el progreso de la electroforesis se controla utilizando tintes de colores. El cianol de xileno (color azul claro) coagula grandes fragmentos de ADN, mientras que el azul de bromofenol (azul oscuro) coagula con los fragmentos más pequeños. Los tintes menos utilizados incluyen Cresol Red y Orange G, que migran antes que el azul de bromofenol. También se procesa un marcador de ADN para la estimación del peso molecular de los fragmentos de ADN. Sin embargo, tenga en cuenta que el tamaño de un ADN circular como los plásmidos no se puede medir con precisión utilizando marcadores estándar a menos que se haya linealizado mediante digestión de restricción , alternativamente se puede usar un marcador de ADN superenrollado.

Tinción y visualización

El gel con iluminación UV: el ADN teñido con bromuro de etidio aparece como bandas naranjas brillantes.

Tanto el ADN como el ARN se visualizan normalmente mediante tinción con bromuro de etidio , que se intercala en los surcos principales del ADN y presenta fluorescencia bajo luz ultravioleta. La intercalación depende de la concentración de ADN y, por lo tanto, una banda con alta intensidad indicará una mayor cantidad de ADN en comparación con una banda de menor intensidad. [12] El bromuro de etidio se puede agregar a la solución de agarosa antes de que se gelifique, o el gel de ADN se puede teñir más tarde después de la electroforesis. No es necesario decolorar el gel, pero puede producir mejores imágenes. Hay otros métodos de tinción disponibles; algunos ejemplos son SYBR Green , GelRed , azul de metileno , azul de cresilo brillante , sulfato de azul Nilo y violeta cristal . [29] SYBR Green, GelRed y otros productos comerciales similares se venden como alternativas más seguras al bromuro de etidio, ya que se ha demostrado que es mutagénico en la prueba de Ames , aunque no se ha establecido realmente la carcinogenicidad del bromuro de etidio. SYBR Green requiere el uso de un transiluminador de luz azul. El ADN teñido con cristal violeta se puede ver bajo luz natural sin el uso de un transiluminador UV, lo cual es una ventaja, sin embargo, es posible que no produzca una banda fuerte.

Cuando se tiñe con bromuro de etidio, el gel se observa con un transiluminador ultravioleta (UV). La luz ultravioleta excita los electrones dentro del anillo aromático del bromuro de etidio y, una vez que regresan al estado fundamental, se libera luz, lo que hace que el ADN y el complejo de bromuro de etidio sean fluorescentes. [12] Los transiluminadores estándar utilizan longitudes de onda de 302/312-nm (UV-B); sin embargo, la exposición del ADN a la radiación UV durante tan solo 45 segundos puede producir daños en el ADN y afectar los procedimientos posteriores, por ejemplo, reduciendo la eficiencia de la transformación . transcripción in vitro y PCR . [30] Por tanto, debería limitarse la exposición del ADN a la radiación ultravioleta. El uso de una longitud de onda más alta de 365 nm (rango UV-A) causa menos daño al ADN pero también produce una fluorescencia mucho más débil con bromuro de etidio. Cuando se pueden seleccionar varias longitudes de onda en el transilumintor, la longitud de onda más corta se utilizaría para capturar imágenes, mientras que la longitud de onda más larga debería utilizarse si es necesario trabajar en el gel durante un período de tiempo prolongado.

El aparato transiluminador también puede contener dispositivos de captura de imágenes, tales como una cámara digital o polaroid, que permiten tomar o imprimir una imagen del gel.

Para la electroforesis en gel de proteínas, las bandas se pueden visualizar con tinciones de Coomassie o de plata .

Cortar rodajas de gel de agarosa. Se debe usar equipo de protección cuando se usa un transiluminador UV.

Procedimientos posteriores

Las bandas de ADN separadas se utilizan a menudo para procedimientos adicionales, y se puede cortar una banda de ADN del gel como una rodaja, disolver y purificar. Sin embargo, los contaminantes pueden afectar algunos procedimientos posteriores, como la PCR, y en algunos casos se puede preferir la agarosa de bajo punto de fusión, ya que contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas. Los geles también se pueden usar para técnicas de transferencia.

En general, el tampón ideal debe tener una buena conductividad, producir menos calor y tener una vida útil prolongada. [31] Hay varios tampones que se utilizan para la electroforesis en agarosa; los más comunes para los ácidos nucleicos incluyen Tris / Acetato / EDTA (TAE) y Tris / Borato / EDTA (TBE). Los tampones utilizados contienen EDTA para inactivar muchas nucleasas que requieren un catión divalente para su función. El borato en el tampón TBE puede ser problemático ya que el borato puede polimerizar y / o interactuar con cis dioles como los que se encuentran en el ARN. TAE tiene la capacidad de amortiguación más baja, pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto.

Se han propuesto muchos otros tampones, por ejemplo, borato de litio (LB), histidina isoeléctrica, tampones de mercancías emparejados con pK, etc .; en la mayoría de los casos, el supuesto fundamento es una corriente más baja (menos calor) o movilidades iónicas emparejadas, lo que conduce a una vida útil más prolongada. El tampón tris-fosfato tiene una gran capacidad tamponadora, pero no se puede utilizar si el ADN extraído se va a utilizar en una reacción sensible al fosfato. LB es relativamente nuevo y es ineficaz para resolver fragmentos mayores de 5 kpb; Sin embargo, con su baja conductividad, se podría usar un voltaje mucho más alto (hasta 35 V / cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Se pudo resolver una diferencia de tamaño tan baja como un par de bases en gel de agarosa al 3% con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM). [32]

Otro sistema de tamponamiento se puede utilizar en aplicaciones específicas, por ejemplo, barbitúrico-ácido de sodio barbitúrico o tris- barbitúricos tampones se pueden utilizar para en electroforesis en gel de agarosa de las proteínas, por ejemplo en la detección de la distribución anormal de las proteínas. [33]

  • Estimación del tamaño de las moléculas de ADN después de la digestión con enzimas de restricción , por ejemplo, en el mapeo de restricción del ADN clonado.
  • Análisis de productos de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, en el diagnóstico genético molecular o la toma de huellas dactilares genéticas
  • Separación de fragmentos de ADN para extracción y purificación.
  • Separación de ADN genómico restringido antes de la transferencia de Southern , o de ARN antes de la transferencia de Northern .
  • Separación de proteínas, por ejemplo, detección de anomalías de proteínas en química clínica . [34]

Los geles de agarosa se moldean y manipulan fácilmente en comparación con otras matrices y los ácidos nucleicos no se alteran químicamente durante la electroforesis. Las muestras también se recuperan fácilmente. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede almacenar en una bolsa de plástico en un refrigerador.

La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debidos al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga de ADN y ARN depende del pH, pero el funcionamiento durante demasiado tiempo puede agotar la capacidad tampón de la solución. Además, es posible que diferentes preparaciones de material genético no migren de manera coherente entre sí, por razones morfológicas o de otro tipo.

A mediados y finales de la década de 1960, se descubrió por primera vez que la agarosa y los geles relacionados eran matrices eficaces para la electroforesis de ADN y ARN. [35]

  • Electroforesis en gel
  • Inmunodifusión , inmunoelectroforesis
  • SDD-AGE
  • Mancha del norte
  • Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
  • Mancha sureña

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