Pantalla azul-blanca
La pantalla azul-blanca es una técnica de detección que permite la detección rápida y conveniente de bacterias recombinantes en experimentos de clonación molecular basados en vectores . Este método de cribado se realiza habitualmente utilizando una cepa bacteriana adecuada , pero también se pueden utilizar otros organismos como la levadura. El ADN de transformación se liga en un vector . A continuación, el vector se inserta en una célula huésped competente viable para la transformación, que luego se hace crecer en presencia de X-gal . Células transformadas con vectores que contienen ADN recombinanteproducirá colonias blancas; las células transformadas con plásmidos no recombinantes (es decir, solo el vector) crecen en colonias azules.
La clonación molecular es uno de los procedimientos más utilizados en biología molecular . Puede insertarse un gen de interés en un vector plasmídico mediante ligación y luego el plásmido se transforma en células de Escherichia coli . Sin embargo, no todos los plásmidos transformados en células pueden contener el inserto de gen deseado, y comprobar la presencia del inserto en cada colonia individual lleva mucho tiempo. Por lo tanto, un método para la detección del inserto sería útil para hacer que este procedimiento requiera menos tiempo y trabajo. Uno de los primeros métodos desarrollados para la detección de insertos es el cribado azul-blanco que permite la identificación de productos exitosos de reacciones de clonación a través del color de la bacteria. colonia.
El método se basa en el principio de α-complementación del gen de la β-galactosidasa . Este fenómeno de α-complementación se demostró por primera vez en el trabajo realizado por Agnes Ullmann en el laboratorio de François Jacob y Jacques Monod , donde se demostró que la función de una β-galactosidasa mutante inactiva con secuencia eliminada se rescataba mediante un fragmento de β-galactosidasa. en el que esa misma secuencia, el péptido donante α, todavía está intacta. [1] Langley y col. mostró que la β-galactosidasa mutante no funcional carecía en parte de su extremo N-terminal con sus residuos 11-41 suprimidos, pero puede complementarse con un péptido formado por los residuos 3-90 de β-galactosidasa.[2] El fago filamentoso M13 que contiene la secuencia que codifica los primeros 145 aminoácidos fue posteriormente construido por Messing et al. , y la complementación α mediante el uso de un vector se demostró mediante la formación de placas azules cuando las células que contenían la proteína inactiva fueron infectadas por el fago y luego se cultivaron en placas que contenían X-gal. [3]
La serie pUC de vectores de clonación de plásmidos de Vieira y Messing se desarrolló a partir del sistema M13 y fueron los primeros plásmidos construidos para aprovechar este método de selección. [4] En este método, el ADN ligado al plásmido interrumpe el péptido α y, por lo tanto, el proceso de complementación, y no se puede formar β-galactosidasa funcional. Por tanto, las células transformadas con plásmido que contiene un inserto forman colonias blancas, mientras que las células transformadas con plásmido sin inserto forman colonias azules; El resultado de una ligadura satisfactoria puede identificarse fácilmente por la coloración blanca de las células formadas a partir de las azules fallidas. [5]
La β-galactosidasa es una proteína codificada por el gen lacZ del operón lac y existe como homotetrámero en su estado activo. Sin embargo, una β-galactosidasa mutante derivada de la cepa M15 de E. coli tiene sus residuos N-terminales 11-41 eliminados y este mutante, el péptido, no puede formar un tetrámero y está inactivo. Sin embargo, esta forma mutante de proteína puede volver completamente a su estado tetramérico activo en presencia de un fragmento N-terminal de la proteína, el péptido α. El rescate de la función de la β-galactosidasa mutante por el péptido α se denomina complementación α.
