Un vector de clonación es un pequeño fragmento de ADN que se puede mantener de forma estable en un organismo y en el que se puede insertar un fragmento de ADN extraño con fines de clonación . [1] El vector de clonación puede ser ADN tomado de un virus , la célula de un organismo superior o puede ser el plásmido de una bacteria. El vector contiene características que permiten la inserción conveniente de un fragmento de ADN en el vector o su eliminación del vector, por ejemplo, a través de la presencia de sitios de restricción . El vector y el ADN extraño pueden tratarse con una enzima de restricción.que corta el ADN, y los fragmentos de ADN así generados contienen extremos romos o salientes conocidos como extremos pegajosos, y el ADN del vector y el ADN extraño con extremos compatibles se pueden unir mediante ligación molecular . Una vez que se ha clonado un fragmento de ADN en un vector de clonación, puede subclonarse adicionalmente en otro vector diseñado para un uso más específico.
Hay muchos tipos de vectores de clonación, pero los más utilizados son los plásmidos modificados genéticamente . La clonación generalmente se realiza primero usando Escherichia coli , y los vectores de clonación en E. coli incluyen plásmidos, bacteriófagos (tales como fagos λ ), cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Sin embargo, algo de ADN no se puede mantener de manera estable en E. coli , por ejemplo, fragmentos de ADN muy grandes, y se pueden usar otros organismos como la levadura. Los vectores de clonación en levadura incluyen cromosomas artificiales de levadura (YAC).
Características de un vector de clonación
Todos los vectores de clonación comúnmente utilizados en biología molecular tienen características clave necesarias para su función, como un sitio de clonación adecuado y un marcador seleccionable. Otros pueden tener características adicionales específicas para su uso. Por motivos de facilidad y conveniencia, la clonación se realiza a menudo utilizando E. coli . Así, los vectores de clonación utilizados suelen tener elementos necesarios para su propagación y mantenimiento en E. coli , como un origen funcional de replicación (ori). El origen de replicación de ColE1 se encuentra en muchos plásmidos. Algunos vectores también incluyen elementos que les permiten mantenerse en otro organismo además de E. coli , y estos vectores se denominan vector lanzadera .
Sitio de clonación
Todos los vectores de clonación tienen características que permiten insertar o eliminar convenientemente un gen en el vector. Este puede ser un sitio de clonación múltiple (MCS) o un polienlazador, que contiene muchos sitios de restricción únicos . Los sitios de restricción en el MCS se escinden primero mediante enzimas de restricción, luego un gen diana amplificado por PCR también digerido con las mismas enzimas se liga en los vectores usando ADN ligasa . La secuencia de ADN diana se puede insertar en el vector en una dirección específica si así se desea. Los sitios de restricción pueden usarse adicionalmente para subclonar en otro vector si es necesario. [2]
Otros vectores de clonación pueden usar topoisomerasa en lugar de ligasa y la clonación puede realizarse más rápidamente sin la necesidad de una digestión por restricción del vector o inserto. En este método de clonación de TOPO , un vector linealizado se activa uniendo la topoisomerasa I a sus extremos, y este vector "activado por TOPO" puede aceptar un producto de PCR ligando ambos extremos 5 'del producto de PCR, liberando la topoisomerasa y formando un vector circular en el proceso. [3] Otro método de clonación sin el uso de digestión de ADN y ligasa es mediante recombinación de ADN , por ejemplo, como se usa en el sistema de clonación Gateway . [4] [5] El gen, una vez clonado en el vector de clonación (llamado clon de entrada en este método), puede introducirse convenientemente en una variedad de vectores de expresión mediante recombinación. [6]
Marcador seleccionable
El vector lleva un marcador seleccionable para permitir la selección de células transformadas positivamente . La resistencia a los antibióticos se usa a menudo como marcador, un ejemplo es el gen de la betalactamasa , que confiere resistencia al grupo de la penicilina de los antibióticos betalactámicos como la ampicilina . Algunos vectores contienen dos marcadores seleccionables, por ejemplo, el plásmido pACYC177 tiene genes de resistencia tanto a ampicilina como a kanamicina . [7] El vector lanzadera que está diseñado para mantenerse en dos organismos diferentes también puede requerir dos marcadores seleccionables, aunque algunos marcadores seleccionables como la resistencia a zeocina e higromicina B son efectivos en diferentes tipos de células. Auxotróficas marcadores de selección que permiten a un organismo auxotrófico para crecer en medio de crecimiento mínimo también puede ser utilizado; ejemplos de estos son LEU2 y URA3 que se utilizan con sus correspondientes cepas auxotróficas de levadura. [8]
Otro tipo de marcador seleccionable permite la selección positiva de plásmido con gen clonado. Esto puede implicar el uso de un gen letal para las células huésped, como barnasa , [9] Ccda , [10] y las toxinas parD / parE . [11] [12] Esto típicamente funciona interrumpiendo o eliminando el gen letal durante el proceso de clonación, y los clones fallidos donde el gen letal aún permanece intacto matarían las células huésped, por lo tanto, solo se seleccionan los clones exitosos.
Gen reportero
Los genes indicadores se utilizan en algunos vectores de clonación para facilitar el cribado de clones exitosos mediante el uso de características de estos genes que permiten identificar fácilmente el clon exitoso. Tales características presentes en los vectores de clonación pueden ser el fragmento α lacZ para la complementación α en la selección azul-blanca , y / o genes marcadores o genes indicadores en el marco y flanqueando el MCS para facilitar la producción de proteínas de fusión . Ejemplos de socios de fusión que pueden usarse para la detección son la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa .
Elementos de expresión
Un vector de clonación no necesita contener elementos adecuados para la expresión de un gen diana clonado, tal como un promotor y un sitio de unión ribosomal (RBS), sin embargo, muchos lo hacen, y luego pueden funcionar como un vector de expresión . El ADN diana puede insertarse en un sitio que está bajo el control de un promotor particular necesario para la expresión del gen diana en el hospedador elegido. Cuando el promotor está presente, la expresión del gen se controla de manera estricta e inducible, de modo que las proteínas solo se producen cuando se requieren. Algunos promotores comúnmente usados son los T7 y lac promotores . La presencia de un promotor es necesaria cuando se utilizan técnicas de cribado como la selección azul-blanca .
A veces se utilizan vectores de clonación sin promotor y RBS para la secuencia de ADN clonado, por ejemplo, cuando se clonan genes cuyos productos son tóxicos para las células de E. coli . El promotor y el RBS para la secuencia de ADN clonado también son innecesarios cuando se hace por primera vez una biblioteca genómica o de ADNc de clones, ya que los genes clonados normalmente se subclonan en un vector de expresión más apropiado si se requiere su expresión.
Algunos vectores están diseñados para la transcripción únicamente sin proteína heteróloga expresada, por ejemplo, para la producción de ARNm in vitro . Estos vectores se denominan vectores de transcripción. Pueden carecer de las secuencias necesarias para la poliadenilación y terminación, por lo que no se pueden utilizar para la producción de proteínas.
Tipos de vectores de clonación
Hay disponible un gran número de vectores de clonación y la elección del vector puede depender de varios factores, como el tamaño del inserto, el número de copias y el método de clonación. El inserto grande puede no mantenerse estable en un vector de clonación general, especialmente para aquellos con un número alto de copias, por lo tanto, la clonación de fragmentos grandes puede requerir un vector de clonación más especializado. [13]
Plásmido
Los plásmidos replican de forma autónoma ADN extracromosómico circular. Son los vectores de clonación estándar y los más utilizados. La mayoría de los plásmidos generales pueden usarse para clonar insertos de ADN de hasta 15 kb de tamaño. Uno de los primeros vectores de clonación comúnmente utilizados es el plásmido pBR322 . Otros vectores de clonación incluyen la serie pUC de plásmidos, y están disponibles un gran número de diferentes vectores de plásmidos de clonación. Muchos plásmidos tienen un alto número de copias, por ejemplo pUC19 que tiene un número de copias de 500-700 copias por célula, [14] y un alto número de copias es útil ya que produce un mayor rendimiento de plásmido recombinante para la manipulación posterior. Sin embargo, los plásmidos de bajo número de copias se pueden usar preferiblemente en determinadas circunstancias, por ejemplo, cuando la proteína del gen clonado es tóxica para las células. [15]
Algunos plásmidos contienen un origen de replicación de bacteriófago M13 y pueden usarse para generar ADN monocatenario. Estos se denominan fagémidos y, por ejemplo, la serie pBluescript de vectores de clonación.
Bacteriófago
Los bacteriófagos utilizados para la clonación son el fago λ y el fago M13 . Existe un límite superior en la cantidad de ADN que se puede empaquetar en un fago (un máximo de 53 kb), por lo tanto, para permitir que se inserte ADN extraño en el ADN del fago, es posible que los vectores de clonación de fagos necesiten eliminar algunos genes no esenciales. , por ejemplo, los genes de la lisogenia, ya que el uso del fago λ como vector de clonación implica solo el ciclo lítico. [16] Hay dos tipos de vectores de fagos λ: vector de inserción y vector de reemplazo. Los vectores de inserción contienen un sitio de escisión único en el que se puede insertar ADN extraño con un tamaño de 5 a 11 kb. En los vectores de reemplazo, los sitios de escisión flanquean una región que contiene genes no esenciales para el ciclo lítico, y esta región puede ser eliminada y reemplazada por el inserto de ADN en el proceso de clonación, y puede insertarse un ADN de mayor tamaño de 8-24 kb. [17]
También existe un límite de tamaño más bajo para el ADN que puede empaquetarse en un fago, y el ADN del vector que es demasiado pequeño no puede empaquetarse adecuadamente en el fago. Esta propiedad se puede utilizar para la selección: el vector sin inserción puede ser demasiado pequeño, por lo tanto, solo los vectores con inserción pueden seleccionarse para la propagación. [18]
Cósmido
Los cósmidos son plásmidos que incorporan un segmento de ADN del bacteriófago λ que tiene el sitio final cohesivo ( cos ) que contiene los elementos necesarios para empaquetar el ADN en partículas λ. Normalmente se utiliza para clonar grandes fragmentos de ADN entre 28 y 45 Kb. [13]
Cromosoma artificial bacteriano
Se puede clonar un tamaño de inserto de hasta 350 kb en un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Los BAC se mantienen en E. coli con un número de copias de solo 1 por célula. [17] Los BAC se basan en el plásmido F , otro cromosoma artificial llamado PAC se basa en el fago P1 .
Cromosoma artificial de levadura
Los cromosomas artificiales de levadura se utilizan como vectores para clonar fragmentos de ADN de más de 1 mega base (1 Mb = 1000 kb) de tamaño. Son útiles en la clonación de fragmentos de ADN más grandes según se requiera en el mapeo de genomas como en el proyecto del genoma humano. Contiene una secuencia telomérica, una secuencia de replicación autónoma (características necesarias para replicar cromosomas lineales en células de levadura). Estos vectores también contienen sitios de restricción adecuados para clonar ADN extraño, así como genes que se utilizarán como marcadores seleccionables.
Cromosoma artificial humano
El cromosoma artificial humano puede ser potencialmente útil como un vector de transferencia de genes para la entrega de genes en células humanas y una herramienta para estudios de expresión y determinación de la función del cromosoma humano. Puede transportar fragmentos de ADN muy grandes (no existe un límite superior de tamaño para fines prácticos), por lo que no tiene el problema de la capacidad de clonación limitada de otros vectores, y también evita una posible mutagénesis insercional causada por la integración en los cromosomas del huésped por virus. vector. [19] [20]
Vectores virales animales y vegetales También se han manipulado virus que infectan células vegetales y animales para introducir genes extraños en células vegetales y animales. La capacidad natural de los virus para adsorberse en las células, introducir su ADN y replicarse los ha convertido en vehículos ideales para transferir ADN extraño a células eucariotas en cultivo. Se usó un vector basado en el virus Simian 40 (SV40) en el primer experimento de clonación que involucraba células de mamífero. Se han utilizado varios vectores basados en otro tipo de virus como los adenovirus y el virus del papiloma para clonar genes en mamíferos. En la actualidad, los vectores retrovirales son populares para clonar genes en células de mamíferos. En el caso de plantas como el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco y los virus Gemini se han utilizado con éxito limitado.
Proyección: ejemplo de pantalla azul / blanca
Muchos vectores de uso general, como pUC19, generalmente incluyen un sistema para detectar la presencia de un fragmento de ADN clonado, basado en la pérdida de un fenotipo fácilmente puntuado. El más utilizado es el gen que codifica la β-galactosidasa de E. coli , cuya actividad puede detectarse fácilmente por la capacidad de la enzima que codifica para hidrolizar el sustrato soluble e incoloro X-gal (5-bromo-4-cloro-3 -indolil-beta-d-galactósido) en un producto azul insoluble (5,5'-dibromo-4,4'-dicloro índigo). La clonación de un fragmento de ADN dentro de la secuencia lacZα basada en un vector de la β-galactosidasa evita la producción de una enzima activa. Si se incluye X-gal en las placas de agar selectivo, las colonias transformantes son generalmente azules en el caso de un vector sin ADN insertado y blancas en el caso de un vector que contiene un fragmento de ADN clonado.
Ver también
- Vector (biología molecular)
- Vector de transformación de plantas
- Clones de ADNc de IMAGEN
- fosmid
- Clonación de Golden Gate
Referencias
- ^ "Definición de vector de clonación" . Diccionario del genoma . Consultado el 18 de octubre de 2012 .
- ^ Gorman; et al. (2015). "Adaptabilidad y reproducibilidad de sitios de restricción y empalme alternativos en vectores de clonación diferencial: un estudio y revisión de la literatura". Revista de tecnología biomolecular . 30 (19): 120-142.
- ^ "La tecnología detrás de la clonación de TOPO®" . Invitrogen .
- ^ Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS (2009). "Clonación de puerta de enlace para la expresión de proteínas" . Expresión y purificación de proteínas de alto rendimiento . Métodos en Biología Molecular. 498 . págs. 31–54 . doi : 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3 . ISBN 978-1-58829-879-9. PMID 18988017 .
- ^ "Métodos de clonación - sistemas de clonación de recombinación" . EMBL .
- ^ "Tecnología de clonación de recombinación Gateway®" . Invitrogen .
- ^ Nicola Casali; Andrew Preston (2003).Vectores de plásmidos de E. coli . Métodos en Biología Molecular. 235 . pag. 23. ISBN 978-1-58829-151-6.
- ^ Romanos MA, Anotador CA, Clare JJ (1992). "Expresión de genes extraños en levadura: una revisión" (PDF) . La levadura . 8 (6): 423–88. doi : 10.1002 / yea.320080602 . PMID 1502852 . S2CID 15674832 .
- ^ Yazynin SA, Deyev SM, Jucovic M, Hartley RW (1996). "Un vector plasmídico con selección positiva y clonación direccional basada en un gen condicionalmente letal" . Gene . 169 (1): 131–2. doi : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00814-4 . PMID 8635737 .
- ^ Philippe Bernard (1996). "Selección positiva de ADN recombinante por CcdB" (PDF) . BioTechniques . 21 (2): 320–323. doi : 10.2144 / 96212pf01 . PMID 8862819 . Archivado desde el original (PDF) el 16 de mayo de 2017 . Consultado el 14 de octubre de 2013 .
- ^ Gabant P, Van Reeth T, Drèze PL, Faelen M, Szpirer C, Szpirer J (2000). "Nuevo sistema de selección positiva basado en el sistema parD (kis / kid) del plásmido R1". BioTechniques . 28 (4): 784–8. PMID 10769758 .
- ^ Kim HG, Kim HS, Hwang HJ, Chung SK, Lee JM, Chung DK (2004). "Construcción de un vector pTOC-T usando toxina GST-ParE para clonación directa y selección de productos de PCR". Cartas de biotecnología . 26 (21): 1659–63. doi : 10.1007 / s10529-004-3518-z . PMID 15604816 . S2CID 10312859 .
- ^ a b Andrew Preston (3 de julio de 2003). Vectores de plásmidos de E. coli . Métodos en Biología Molecular. 235 . págs. 19-20. ISBN 978-1-58829-151-6.
- ^ Nicola Casali; Andrew Preston (2003). Vectores de plásmidos de E. coli: métodos y aplicaciones . Prensa de Humn. pag. 22 . ISBN 978-1588291516.
- ^ "Número de copia" . Instituto de Genética, Inc . Archivado desde el original el 19 de abril de 2013 . Consultado el 6 de marzo de 2013 .
- ^ BR Glick; JJ Pasternak (2005). Principios y aplicaciones de la biotecnología molecular del ADN recombinante (3ª ed.). Prensa ASM. ISBN 9781555816124.
- ^ a b Andrew Preston (3 de julio de 2003). Vectores de plásmidos de E. coli (PDF) . Métodos en Biología Molecular. 235 . págs. 21-22. ISBN 978-1-58829-151-6.
- ^ TA Brown (19 de abril de 2010). Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción . Wiley-Blackwell. pag. 100. ISBN 978-1444334074.
- ^ Kim JH, Kononenko A, Erliandri I, Kim TA, Nakano M, Iida Y, Barrett JC, Oshimura M, Masumoto H, Earnshaw WC, Larionov V, Kouprina N (13 de diciembre de 2011). "Vector de cromosoma artificial humano (HAC) con un centrómero condicional para la corrección de deficiencias genéticas en células humanas" . Proc Natl Acad Sci USA . 108 (50): 20048–53. Código bibliográfico : 2011PNAS..10820048K . doi : 10.1073 / pnas.1114483108 . PMC 3250132 . PMID 22123967 .
- ^ Kouprina N, Earnshaw WC, Masumoto H, Larionov V (2013). "Una nueva generación de cromosomas artificiales humanos para genómica funcional y terapia génica" . Ciencias de la vida celular y molecular . 70 (7): 1135–48. doi : 10.1007 / s00018-012-1113-3 . PMC 3522797 . PMID 22907415 .