En biología, un ensayo de ADN ramificado es un ensayo de amplificación de señales (a diferencia de un ensayo de amplificación de diana) que se utiliza para detectar moléculas de ácido nucleico . [1]
Un ensayo de ADN ramificado comienza con una placa o algún otro soporte sólido (por ejemplo, una varilla de plástico). El plato está salpicado de pequeñas moléculas de ADN de una sola hebra (o cadenas) que 'sobresalen' en el aire. Estos se conocen como moléculas de ADN de sonda de captura. A continuación, se agrega una molécula de ADN extensor. Cada extensor tiene dos dominios; uno que se hibrida con la molécula de ADN de captura y otro que "cuelga" en el aire. El propósito del extensor es doble. Primero, crea más área de superficie disponible para que se unan las moléculas de ADN objetivo, y segundo, permite que el ensayo se adapte fácilmente para detectar una variedad de moléculas de ADN objetivo.
Una vez que las moléculas de captura y extensor están en su lugar y se han hibridado, se puede agregar la muestra. Las moléculas diana en la muestra se unirán a la molécula extensor. Esto da como resultado una base salpicada de sondas de captura, que se hibridan con sondas extensoras, que a su vez se hibridan con moléculas diana.
En este punto, tiene lugar la amplificación de la señal. Se agrega una molécula de ADN extensor de marca que tiene dos dominios (similar al primer extensor). El extensor de marca se hibrida con la diana y con una molécula preamplificada. La molécula de preamplificador tiene dos dominios. Primero, se une al extensor de la etiqueta y segundo, se une a la molécula amplificadora. Un ejemplo de molécula amplificadora es una cadena de oligonucleótidos unida a la enzima fosfatasa alcalina .
En forma de diagrama, el proceso puede parecerse a
Base → Sonda de captura → Extensor → Destino → extensor de etiquetas → preamplificador → amplificador
El ensayo se puede utilizar para detectar y cuantificar muchos tipos de ARN o ADN diana. En el ensayo, el ADN ramificado se mezcla con una muestra que se va a analizar. La detección se realiza mediante un método no radiactivo y no requiere preamplificación del ácido nucleico para ser detectado. El ensayo se basa completamente en la hibridación. Las enzimas se usan para indicar el grado de hibridación pero no se usan para manipular los ácidos nucleicos. Por tanto, pueden detectarse y cuantificarse pequeñas cantidades de un ácido nucleico sin una etapa de transcripción inversa (en el caso del ARN) y / o PCR . El ensayo se puede ejecutar como un ensayo de alto rendimiento, a diferencia de la transferencia Northern cuantitativao el ensayo de protección de la ARNasa, que requiere mucha mano de obra y, por lo tanto, es difícil de realizar en un gran número de muestras. La otra técnica importante de alto rendimiento empleada en la cuantificación de moléculas de ARN específicas es la PCR cuantitativa , después de la transcripción inversa del ARN a ADNc .