Una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real ( PCR en tiempo real ), también conocida como reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa ( qPCR ), es una técnica de laboratorio de biología molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Controla la amplificación de una molécula de ADN dirigida durante la PCR (es decir, en tiempo real), no al final, como en la PCR convencional. La PCR en tiempo real se puede utilizar cuantitativamente (PCR cuantitativa en tiempo real) y semicuantitativamente (es decir, por encima o por debajo de una cierta cantidad de moléculas de ADN) (PCR semicuantitativa en tiempo real).
Dos métodos comunes para la detección de productos de PCR en PCR en tiempo real son (1) tintes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier ADN bicatenario y (2) sondas de ADN específicas de secuencia que consisten en oligonucleótidos que están marcados con un indicador fluorescente , que permite la detección solo después de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria.
Las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real (MIQE) proponen que se utilice la abreviatura qPCR para la PCR cuantitativa en tiempo real y que RT-qPCR se utilice para la transcripción inversa: qPCR. [1] El acrónimo "RT-PCR" comúnmente denota reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y no PCR en tiempo real, pero no todos los autores se adhieren a esta convención. [2]
Fondo
Las células de todos los organismos regulan la expresión génica mediante el recambio de transcripciones de genes ( ARN monocatenario ): la cantidad de un gen expresado en una célula se puede medir por el número de copias de una transcripción de ARN de ese gen presente en una muestra. Para detectar y cuantificar de manera robusta la expresión génica a partir de pequeñas cantidades de ARN, es necesaria la amplificación de la transcripción del gen. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método común para amplificar el ADN; para la PCR basada en ARN, la muestra de ARN primero se transcribe de forma inversa a ADN complementario (ADNc) con transcriptasa inversa .
Para amplificar pequeñas cantidades de ADN, se usa la misma metodología que en la PCR convencional usando una plantilla de ADN, al menos un par de cebadores específicos , desoxirribonucleótidos , una solución tampón adecuada y una ADN polimerasa termoestable . Una sustancia marcada con un fluoróforo se agrega a esta mezcla en un termociclador que contiene sensores para medir la fluorescencia del fluoróforo después de que se haya excitado a la longitud de onda requerida, lo que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Esto permite medir la velocidad de generación del producto amplificado en cada ciclo de PCR. Los datos así generados pueden analizarse mediante software informático para calcular la expresión génica relativa (o el número de copias de ARNm ) en varias muestras. La PCR cuantitativa también se puede aplicar a la detección y cuantificación de ADN en muestras para determinar la presencia y abundancia de una secuencia de ADN particular en estas muestras. [3] Esta medida se realiza después de cada ciclo de amplificación, por lo que este método se denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata o simultánea). En el caso de la cuantificación de ARN, la plantilla es ADN complementario (ADNc), que se obtiene mediante transcripción inversa de ácido ribonucleico (ARN). En este caso, la técnica utilizada es RT-PCR cuantitativa o Q-RT-PCR.
La PCR cuantitativa y la micromatriz de ADN son metodologías modernas para estudiar la expresión génica . Se utilizaron métodos más antiguos para medir la abundancia de ARNm: presentación diferencial , ensayo de protección de ARNasa y transferencia Northern . La transferencia Northern se usa a menudo para estimar el nivel de expresión de un gen visualizando la abundancia de su transcrito de ARNm en una muestra. En este método, el ARN purificado se separa mediante electroforesis en gel de agarosa , se transfiere a una matriz sólida (como una membrana de nailon) y se prueba con una sonda de ADN o ARN específica que es complementaria al gen de interés. Aunque esta técnica todavía se usa para evaluar la expresión génica, requiere cantidades relativamente grandes de ARN y proporciona solo información cualitativa o semicuantitativa de los niveles de ARNm. [4] Los errores de estimación que surgen de variaciones en el método de cuantificación pueden ser el resultado de la integridad del ADN, la eficiencia de la enzima y muchos otros factores. Por esta razón, se han desarrollado varios sistemas de normalización (a menudo denominados métodos de normalización ). Algunos se han desarrollado para cuantificar la expresión génica total, pero los más comunes tienen como objetivo cuantificar el gen específico que se está estudiando en relación con otro gen llamado gen normalizador, que se selecciona por su nivel de expresión casi constante. Estos genes a menudo se seleccionan de genes domésticos, ya que sus funciones relacionadas con la supervivencia celular básica normalmente implican una expresión genética constitutiva . [5] [6] Esto permite a los investigadores informar una proporción para la expresión de los genes de interés dividida por la expresión del normalizador seleccionado, lo que permite la comparación del primero sin conocer realmente su nivel absoluto de expresión.
Los genes normalizadores más utilizados son los que codifican las siguientes moléculas: tubulina , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa , albúmina , ciclofilina y ARN ribosómico . [4]
Principios básicos
La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad para iluminar cada muestra con un haz de luz de al menos una longitud de onda especificada y detectar la fluorescencia emitida por el fluoróforo excitado . El termociclador también puede calentar y enfriar rápidamente muestras, aprovechando así las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y la ADN polimerasa .
El proceso de PCR generalmente consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten entre 25 y 50 veces. Estos ciclos normalmente constan de tres etapas: la primera, a unos 95 ° C, permite la separación de la doble cadena del ácido nucleico; el segundo, a una temperatura de alrededor de 50-60 ° C, permite la unión de los cebadores con la plantilla de ADN; [7] el tercero, entre 68 y 72 ° C, facilita la polimerización realizada por la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos, el último paso generalmente se omite en este tipo de PCR ya que la enzima es capaz de replicar el amplicón de ADN durante el cambio entre la etapa de alineación y la etapa de desnaturalización. Además, en la PCR de cuatro pasos se mide la fluorescencia durante fases cortas de temperatura que duran solo unos segundos en cada ciclo, con una temperatura de, por ejemplo, 80 ° C, con el fin de reducir la señal provocada por la presencia de dímeros de cebadores. cuando se usa un tinte no específico. [8] Las temperaturas y los tiempos utilizados para cada ciclo dependen de una amplia variedad de parámetros, tales como: la enzima utilizada para sintetizar el ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTP) en la reacción y la temperatura de enlace del imprimaciones. [9]
Clasificación química
La técnica de PCR en tiempo real se puede clasificar por la química utilizada para detectar el producto de PCR, fluorocromos específicos o inespecíficos.
Detección no específica: PCR en tiempo real con tintes de unión al ADN de doble hebra como indicadores
Se liga de colorante A de unión a ADN a todos de doble cadena (ds) de ADN en la PCR, el aumento del rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante. Por tanto, un aumento del producto de ADN durante la PCR conduce a un aumento de la intensidad de la fluorescencia medida en cada ciclo. Sin embargo, los tintes de dsDNA como SYBR Green se unirán a todos los productos de PCR de dsDNA, incluidos los productos de PCR no específicos (como el dímero de cebador ). Esto puede interferir potencialmente con, o prevenir, la monitorización precisa de la secuencia objetivo deseada.
En la PCR en tiempo real con tintes de dsDNA, la reacción se prepara como de costumbre, con la adición de un tinte fluorescente de dsDNA. Luego, la reacción se ejecuta en un instrumento de PCR en tiempo real y, después de cada ciclo, se mide la intensidad de la fluorescencia con un detector; el tinte solo emite fluorescencia cuando se une al dsDNA (es decir, el producto de PCR). Este método tiene la ventaja de que solo necesita un par de cebadores para llevar a cabo la amplificación, lo que mantiene bajos los costos; Se pueden monitorear múltiples secuencias diana en un tubo usando diferentes tipos de colorantes.
Detección específica: método de sonda informadora fluorescente
Las sondas informadoras fluorescentes detectan solo el ADN que contiene la secuencia complementaria a la sonda; por lo tanto, el uso de la sonda indicadora aumenta significativamente la especificidad y permite realizar la técnica incluso en presencia de otro dsDNA. Usando etiquetas de diferentes colores, se pueden usar sondas fluorescentes en ensayos multiplex para monitorear varias secuencias diana en el mismo tubo. La especificidad de las sondas indicadoras fluorescentes también evita la interferencia de las mediciones causada por los dímeros de los cebadores , que son subproductos potenciales indeseables en la PCR. Sin embargo, las sondas indicadoras fluorescentes no evitan el efecto inhibidor de los dímeros de los cebadores, que pueden deprimir la acumulación de los productos deseados en la reacción.
El método se basa en una sonda basada en ADN con un indicador fluorescente en un extremo y un atenuador de fluorescencia en el extremo opuesto de la sonda. La gran proximidad del informador al extintor evita la detección de su fluorescencia; la ruptura de la sonda por la actividad exonucleasa 5 'a 3' de la polimerasa Taq rompe la proximidad reportero-inactivador y así permite la emisión de fluorescencia sin apagar, que puede detectarse después de la excitación con un láser. Por lo tanto, un aumento en el producto objetivo de la sonda indicadora en cada ciclo de PCR provoca un aumento proporcional de la fluorescencia debido a la ruptura de la sonda y la liberación del informador.
- La PCR se prepara como de costumbre (ver PCR ) y se agrega la sonda informadora.
- A medida que comienza la reacción, durante la etapa de hibridación de la PCR, tanto la sonda como los cebadores se hibridan con el ADN diana.
- La polimerización de una nueva hebra de ADN se inicia a partir de los cebadores, y una vez que la polimerasa llega a la sonda, su 5'-3'-exonucleasa degrada la sonda, separando físicamente el informador fluorescente del extintor, lo que da como resultado un aumento de la fluorescencia.
- La fluorescencia se detecta y mide en una máquina de PCR en tiempo real, y su aumento geométrico correspondiente al aumento exponencial del producto se utiliza para determinar el ciclo de cuantificación (C q ) en cada reacción.
Análisis de temperatura de fusión
PCR en tiempo real permite la identificación de específico, fragmentos de ADN amplificados utilizando análisis de su temperatura de fusión (también llamado T m de valor, desde m Elting t emperatura ). El método utilizado suele ser la PCR con tintes de unión al ADN de doble hebra como indicadores y el tinte utilizado suele ser SYBR Green. La temperatura de fusión del ADN es específica del fragmento amplificado. Los resultados de esta técnica se obtienen comparando las curvas de disociación de las muestras de ADN analizadas. [11]
A diferencia de la PCR convencional, este método evita el uso previo de técnicas de electroforesis para demostrar los resultados de todas las muestras. Esto se debe a que, a pesar de ser una técnica cinética, la PCR cuantitativa generalmente se evalúa en un punto final distinto. Por lo tanto, la técnica generalmente proporciona resultados más rápidos y / o usa menos reactivos que la electroforesis. Si se requiere una electroforesis posterior, solo es necesario analizar aquellas muestras que la PCR en tiempo real ha demostrado ser dudosas y / o ratificar los resultados de las muestras que han dado positivo para un determinante específico.
Modelado
A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite monitorear el producto deseado en cualquier punto del proceso de amplificación midiendo la fluorescencia (en un marco de tiempo real, la medición se realiza a partir de un umbral determinado). Un método comúnmente empleado de cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real se basa en graficar la fluorescencia frente al número de ciclos en una escala logarítmica . Se establece un umbral para la detección de fluorescencia basada en ADN de 3 a 5 veces la desviación estándar del ruido de la señal por encima del fondo. El número de ciclos en los que la fluorescencia supera el umbral se denomina ciclo umbral (C t ) o, según las directrices del MIQE, ciclo de cuantificación (C q ) . [12]
Durante la fase de amplificación exponencial, la cantidad de la plantilla de ADN diana (amplicón) se duplica en cada ciclo. Por ejemplo, una muestra de ADN cuyo C q precede al de otra muestra en 3 ciclos contenía 2 3 = 8 veces más plantilla. Sin embargo, la eficacia de la amplificación a menudo varía entre los cebadores y las plantillas. Por lo tanto, la eficacia de una combinación de cebador y plantilla se evalúa en un experimento de titulación con diluciones en serie de la plantilla de ADN para crear una curva estándar del cambio en (C q ) con cada dilución. La pendiente de la regresión lineal se usa luego para determinar la eficiencia de amplificación, que es del 100% si una dilución de 1: 2 da como resultado una diferencia (C q ) de 1. El método de umbral de ciclo hace varias suposiciones del mecanismo de reacción y tiene una dependencia de los datos de las regiones de baja señal a ruido del perfil de amplificación que pueden introducir una variación sustancial durante el análisis de datos. [13]
Para cuantificar la expresión génica, la (C q ) de un ARN o ADN del gen de interés se resta de la (C q ) de ARN / ADN de un gen de mantenimiento en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad de ARN entre diferentes muestras. Este procedimiento de normalización se denomina comúnmente método ΔC t [14] y permite comparar la expresión de un gen de interés entre diferentes muestras. Sin embargo, para tal comparación, la expresión del gen de referencia normalizador debe ser muy similar en todas las muestras. La elección de un gen de referencia que cumpla este criterio es, por lo tanto, de gran importancia y, a menudo, desafiante, porque solo muy pocos genes muestran niveles iguales de expresión en una variedad de condiciones o tejidos diferentes. [15] [16] Aunque el análisis de umbral de ciclo está integrado con muchos sistemas de software comerciales, existen métodos más precisos y confiables para analizar los datos del perfil de amplificación que deben considerarse en los casos en que la reproducibilidad es una preocupación. [13]
También se han sugerido métodos de cuantificación de qPCR basados en mecanismos, y tienen la ventaja de que no requieren una curva estándar para la cuantificación. Se ha demostrado que métodos como MAK2 [17] tienen un rendimiento cuantitativo igual o mejor que los métodos de curva estándar. Estos métodos basados en mecanismos utilizan el conocimiento sobre el proceso de amplificación de la polimerasa para generar estimaciones de la concentración de la muestra original. Una extensión de este enfoque incluye un modelo preciso de todo el perfil de reacción de PCR, lo que permite el uso de datos de alta relación señal-ruido y la capacidad de validar la calidad de los datos antes del análisis. [13]
Según la investigación de Ruijter et al. [18] MAK2 asume una eficiencia de amplificación constante durante la reacción de PCR. Sin embargo, el análisis teórico de la reacción en cadena de la polimerasa, de la que se derivó MAK2, ha revelado que la eficacia de la amplificación no es constante durante toda la PCR. Si bien la cuantificación de MAK2 proporciona estimaciones fiables de la concentración de ADN objetivo en una muestra en condiciones normales de qPCR, MAK2 no cuantifica de forma fiable la concentración objetivo para los ensayos de qPCR con competímetros.
Aplicaciones
Existen numerosas aplicaciones para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en el laboratorio . Se utiliza comúnmente tanto para diagnóstico como para investigación básica . Los usos de la técnica en la industria incluyen la cuantificación de la carga microbiana en alimentos o en materia vegetal, la detección de OGM (organismos genéticamente modificados ) y la cuantificación y genotipificación de patógenos virales humanos.
Cuantificación de la expresión génica
La cuantificación de la expresión génica mediante métodos tradicionales de detección de ADN no es fiable. La detección de ARNm en una transferencia Northern o productos de PCR en un gel o transferencia Southern no permite una cuantificación precisa. [19] Por ejemplo, durante los 20 a 40 ciclos de una PCR típica, la cantidad de producto de ADN alcanza una meseta que no está directamente correlacionada con la cantidad de ADN diana en la PCR inicial. [20]
La PCR en tiempo real se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos mediante dos métodos comunes: cuantificación relativa y cuantificación absoluta. [21] La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN diana en comparación con los estándares de ADN utilizando una curva de calibración . Por tanto, es fundamental que la PCR de la muestra y el estándar tengan la misma eficacia de amplificación . [22] La cuantificación relativa se basa en genes de referencia internos para determinar las diferencias en la expresión del gen diana. La cuantificación se expresa como el cambio en los niveles de expresión de ARNm interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por transcripción inversa de ARNm). La cuantificación relativa es más fácil de realizar ya que no requiere una curva de calibración ya que la cantidad del gen estudiado se compara con la cantidad de un gen de referencia de control.
Dado que las unidades utilizadas para expresar los resultados de la cuantificación relativa no son importantes, los resultados se pueden comparar entre varios RTqPCR diferentes. La razón para utilizar uno o más genes internos es corregir variaciones inespecíficas, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN utilizado, que pueden afectar la eficiencia de la transcripción inversa y, por lo tanto, la de todo el proceso de PCR. Sin embargo, el aspecto más crucial del proceso es que el gen de referencia debe ser estable. [23]
La selección de estos genes de referencia se realizaba tradicionalmente en biología molecular mediante estudios cualitativos o semicuantitativos como el examen visual de geles de ARN, densitometría de transferencia Northern o PCR semicuantitativa (imitadores de PCR). Ahora, en la era del genoma , es posible realizar una estimación más detallada para muchos organismos utilizando tecnologías transcriptómicas . [24] Sin embargo, la investigación ha demostrado que la amplificación de la mayoría de los genes de referencia utilizados para cuantificar la expresión del ARNm varía según las condiciones experimentales. [25] [26] [27] Por lo tanto, es necesario realizar un estudio metodológico inicial estadísticamente sólido para seleccionar el gen de referencia más adecuado.
Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que pueden detectar qué gen o genes son los más adecuados para su uso en determinadas condiciones. Aquellos como geNORM o BestKeeper pueden comparar pares o medias geométricas para una matriz de diferentes genes y tejidos de referencia . [28] [29]
Usos diagnósticos
La PCR cualitativa de diagnóstico se aplica para detectar rápidamente ácidos nucleicos que son diagnósticos de, por ejemplo, enfermedades infecciosas , cáncer y anomalías genéticas. La introducción de ensayos de PCR cualitativos en el laboratorio de microbiología clínica ha mejorado significativamente el diagnóstico de enfermedades infecciosas, [30] y se utiliza como una herramienta para detectar enfermedades emergentes, como nuevas cepas de gripe y coronavirus , [31] en pruebas de diagnóstico. . [32] [33]
Usos microbiológicos
La PCR cuantitativa también la utilizan los microbiólogos que trabajan en los campos de la seguridad alimentaria, el deterioro y la fermentación de los alimentos y para la evaluación del riesgo microbiano de la calidad del agua (aguas potables y recreativas) y en la protección de la salud pública. [34]
La qPCR también puede usarse para amplificar marcadores taxonómicos o funcionales de genes en ADN tomado de muestras ambientales. [35] Los marcadores están representados por fragmentos genéticos de ADN o ADN complementario. [35] Al amplificar un determinado elemento genético, se puede cuantificar la cantidad del elemento en la muestra antes de la amplificación. [35] El uso de marcadores taxonómicos (genes ribosómicos) y qPCR puede ayudar a determinar la cantidad de microorganismos en una muestra y puede identificar diferentes familias, géneros o especies según la especificidad del marcador. [35] El uso de marcadores funcionales (genes que codifican proteínas) puede mostrar la expresión génica dentro de una comunidad, lo que puede revelar información sobre el medio ambiente. [35]
Detección de fitopatógenos
La industria agrícola se esfuerza constantemente por producir propágulos de plantas o plántulas libres de patógenos para evitar pérdidas económicas y salvaguardar la salud. Se han desarrollado sistemas que permiten la detección de pequeñas cantidades del ADN de Phytophthora ramorum , un oomiceto que mata a los robles y otras especies, mezclado con el ADN de la planta huésped. La discriminación entre el ADN del patógeno y la planta se basa en la amplificación de las secuencias ITS, espaciadores ubicados en el área de codificación del gen del ARN ribosómico , que son característicos de cada taxón. [36] También se han desarrollado versiones de campo de esta técnica para identificar el mismo patógeno. [37]
Detección de organismos modificados genéticamente
La qPCR que usa transcripción inversa (RT-qPCR) se puede usar para detectar OGM dada su sensibilidad y rango dinámico en la detección de ADN. Las alternativas como el análisis de ADN o de proteínas suelen ser menos sensibles. Se utilizan cebadores específicos que amplifican no el transgén sino el promotor , terminador o incluso secuencias intermedias utilizadas durante el proceso de ingeniería del vector. Como el proceso de creación de una planta transgénica normalmente conduce a la inserción de más de una copia del transgén, su cantidad también se evalúa comúnmente. Esto a menudo se lleva a cabo mediante cuantificación relativa utilizando un gen de control de la especie tratada que solo está presente como una única copia. [38] [39]
Cuantificación clínica y genotipado
Los virus pueden estar presentes en humanos debido a infecciones directas o coinfecciones, lo que dificulta el diagnóstico mediante técnicas clásicas y puede resultar en un pronóstico y tratamiento incorrectos . El uso de qPCR permite tanto la cuantificación y genotipado (caracterización de la cepa, llevado a cabo utilizando las curvas de fusión) de un virus como el virus de la hepatitis B . [40] El grado de infección, cuantificado como las copias del genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios . [41] Esta cuantificación se realiza con transcripción inversa o sin ella, como ocurre si el virus se integra en el genoma humano en cualquier punto de su ciclo, como ocurre en el caso del VPH (virus del papiloma humano), donde algunos de sus variantes están asociadas a la aparición de cáncer de cuello uterino . [42] La PCR en tiempo real también ha permitido cuantificar el citomegalovirus humano (CMV) que se observa en pacientes inmunosuprimidos después de un trasplante de órganos sólidos o de médula ósea. [43]
Referencias
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