La reacción en cadena de la polimerasa digital ( PCR digital , DigitalPCR , dPCR o dePCR ) es un refinamiento biotecnológico de los métodos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa que se puede utilizar para cuantificar directamente y amplificar clonalmente cadenas de ácidos nucleicos, incluidos ADN , ADNc o ARN . La diferencia clave entre la dPCR y la PCR tradicional radica en el método de medición de las cantidades de ácidos nucleicos, siendo el primero un método más preciso que la PCR, aunque también más propenso a errores en manos de usuarios inexpertos. [1]Una medida "digital" mide cuantitativa y discretamente una determinada variable, mientras que una medida "analógica" extrapola determinadas medidas basándose en patrones medidos. La PCR lleva a cabo una reacción por muestra única. La dPCR también lleva a cabo una sola reacción dentro de una muestra, sin embargo, la muestra se separa en un gran número de particiones y la reacción se lleva a cabo en cada partición individualmente. Esta separación permite una recolección más confiable y una medición sensible de las cantidades de ácido nucleico. Se ha demostrado que el método es útil para estudiar variaciones en secuencias de genes, como variantes de número de copias y mutaciones puntuales, y se utiliza de forma rutinaria para la amplificación clonal de muestras para la secuenciación de próxima generación .
Principios
El método de reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para cuantificar ácidos nucleicos amplificando una molécula de ácido nucleico con la enzima ADN polimerasa . [2] La PCR convencional se basa en la teoría de que la amplificación es exponencial. Por tanto, los ácidos nucleicos pueden cuantificarse comparando el número de ciclos de amplificación y la cantidad de producto final de la PCR con los de una muestra de referencia. Sin embargo, muchos factores complican este cálculo, creando incertidumbres e inexactitudes. Estos factores incluyen lo siguiente: los ciclos de amplificación iniciales pueden no ser exponenciales; La amplificación por PCR finalmente se estabiliza después de un número incierto de ciclos; y las bajas concentraciones iniciales de moléculas de ácido nucleico diana pueden no amplificarse a niveles detectables. Sin embargo, la limitación más significativa de la PCR es que la eficacia de la amplificación de la PCR en una muestra de interés puede ser diferente a la de las muestras de referencia. Dado que la PCR es un proceso exponencial, solo se pueden observar dos diferencias en la amplificación, lo que tiene un gran impacto en la validez y precisión de los resultados.
En lugar de realizar una reacción por pocillo, la dPCR implica dividir la solución de PCR en decenas de miles de gotas de tamaño nanométrico, donde tiene lugar una reacción de PCR separada en cada una. [3] [4] Una solución de PCR se elabora de manera similar a un ensayo TaqMan , que consta de ADN molde (o ARN), sondas extintoras de fluorescencia, cebadores y una mezcla maestra de PCR , que contiene ADN polimerasa , dNTP , MgCl 2 , y tampones de reacción a concentraciones óptimas. Se pueden usar varios métodos diferentes para dividir muestras, incluidas placas de micropocillos, capilares, emulsión de aceite y matrices de cámaras miniaturizadas con superficies de unión de ácido nucleico. [5] La solución de PCR se divide en reacciones más pequeñas y luego se hace ejecutar PCR individualmente. Después de múltiples ciclos de amplificación por PCR, se comprueba la fluorescencia de las muestras con una lectura binaria de "0" o "1". Se registra la fracción de gotitas fluorescentes. [4] La partición de la muestra permite estimar el número de moléculas diferentes asumiendo que la población de moléculas sigue la distribución de Poisson , lo que explica la posibilidad de que múltiples moléculas diana habiten en una sola gota. Utilizando la ley de Poisson de los números pequeños, la distribución de la molécula objetivo dentro de la muestra se puede aproximar con precisión, lo que permite una cuantificación de la hebra objetivo en el producto de PCR. [6] Este modelo simplemente predice que a medida que aumenta el número de muestras que contienen al menos una molécula objetivo, aumenta la probabilidad de que las muestras contengan más de una molécula objetivo. En la PCR convencional, el número de ciclos de amplificación por PCR es proporcional al número de copias iniciales. A diferencia de la creencia de muchas personas de que la dPCR proporciona una cuantificación absoluta, la PCR digital utiliza el poder estadístico para proporcionar una cuantificación relativa. Por ejemplo, si la Muestra A, cuando se analiza en 1 millón de particiones, da una reacción positiva, no significa que la Muestra A tenga una molécula inicial.
Los beneficios de dPCR incluyen una mayor precisión a través de una partición masiva de muestras, lo que garantiza mediciones confiables en la secuencia de ADN deseada debido a la reproducibilidad. [4] Las tasas de error son mayores cuando se detectan diferencias de cambio pequeñas con PCR básica, mientras que las tasas de error son menores con dPCR debido a las diferencias de cambio menores que se pueden detectar en la secuencia de ADN. La técnica en sí reduce el uso de un volumen mayor de reactivo necesario, lo que inevitablemente reducirá el costo del experimento. Además, la dPCR es altamente cuantitativa ya que no depende de la fluorescencia relativa de la solución para determinar la cantidad de ADN diana amplificado.
Comparación entre dPCR y PCR en tiempo real (qPCR)
La dPCR mide el número real de moléculas (ADN diana) ya que cada molécula está en una gota, lo que la convierte en una medida "digital" discreta. Proporciona una cuantificación absoluta porque la dPCR mide la fracción positiva de las muestras, que es el número de gotas que emiten fluorescencia debido a una amplificación adecuada. Esta fracción positiva indica con precisión la cantidad inicial de ácido nucleico molde. De manera similar, qPCR utiliza fluorescencia; sin embargo, mide la intensidad de la fluorescencia en momentos específicos (generalmente después de cada ciclo de amplificación) para determinar la cantidad relativa de molécula diana (ADN), pero no puede especificar la cantidad exacta sin construir una curva estándar usando diferentes cantidades de un estándar definido. Da el umbral por ciclo (CT) y la diferencia en CT se usa para calcular la cantidad de ácido nucleico inicial. Como tal, qPCR es una medida analógica, que puede no ser tan precisa debido a la extrapolación necesaria para obtener una medida. [5] [7]
La dPCR mide la cantidad de ADN después de que se completa la amplificación y luego determina la fracción de réplicas. Esto es representativo de una medición de punto final, ya que requiere la observación de los datos después de que se completa el experimento. Por el contrario, qPCR registra la fluorescencia relativa del ADN en puntos específicos durante el proceso de amplificación, lo que requiere paradas en el proceso experimental. Este aspecto de "tiempo real" de qPCR puede afectar teóricamente los resultados debido a la detención del experimento. [ cita requerida ] Sin embargo, en la práctica, la mayoría de los termocicladores qPCR leen la fluorescencia de cada muestra muy rápidamente al final del paso de recocido / extensión antes de pasar al siguiente paso de fusión, lo que significa que esta preocupación hipotética no es realmente relevante o aplicable para la gran mayoría de investigadores. La dPCR mide la amplificación midiendo los productos de los ciclos de PCR del punto final y, por lo tanto, es menos susceptible a los artefactos que surgen de las eficiencias de amplificación deterioradas debido a la presencia de inhibidores de PCR o desajuste de la plantilla del cebador. [8] [9]
qPCR no puede distinguir diferencias en la expresión génica o variaciones en el número de copias que son más pequeñas que el doble. Por otro lado, el dPCR tiene una mayor precisión y se ha demostrado que detecta diferencias de menos del 30% en la expresión génica, distingue entre variaciones en el número de copias que difieren en solo 1 copia e identifica alelos que ocurren en frecuencias inferiores al 0,1%. [10] [11]
Aplicaciones
La PCR digital tiene muchas aplicaciones en la investigación básica , el diagnóstico clínico y las pruebas ambientales. Sus usos incluyen detección de patógenos y análisis de salud digestiva ; [12] [13] biopsia líquida para el control del cáncer , control del rechazo de trasplantes de órganos y pruebas prenatales no invasivas para detectar anomalías genéticas graves ; [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] análisis de variación del número de copias , [22] [23] [24] análisis de expresión de un solo gen, [25] detección de secuencias raras, [21] [26] [27] perfiles de expresión génica y análisis unicelular ; [28] [29] [27] [30] [31] [32] [33] la detección de contaminantes de ADN en el bioprocesamiento, [34] la validación de ediciones de genes y la detección de cambios de metilación específicos en el ADN como biomarcadores de cáncer . [35] [36] [37] [38] La dPCR también se usa con frecuencia como un método ortogonal para confirmar mutaciones raras detectadas mediante secuenciación de próxima generación (NGS) y para validar bibliotecas de NGS . [39] [40] [41]
Cuantificación absoluta
La dPCR permite la cuantificación absoluta y reproducible de ácidos nucleicos diana con resolución de una sola molécula. [27] [42] [43] [44] Sin embargo, a diferencia de la PCR cuantitativa análoga (qPCR), la cuantificación absoluta con dPCR no requiere una curva estándar ). [42] La dPCR también tiene una mayor tolerancia a las sustancias inhibidoras y los ensayos de PCR que amplifican de manera ineficaz en comparación con la qPCR. [45] [46]
La dPCR puede cuantificar, por ejemplo, la presencia de secuencias específicas de organismos modificados genéticamente contaminantes en los alimentos, [47] carga viral en la sangre, [48] PBMC , [49] [50] muestras de suero, [51] tejidos de vellosidades coriónicas, [49] [50] biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas en el líquido cefalorraquídeo, [52] y contaminación fecal en el agua potable. [53]
Variación del número de copias
Una alteración en el estado del número de copias con respecto a un locus de referencia de una sola copia se denomina " variación del número de copias " (CNV) si aparece en las células de la línea germinal, o una alteración del número de copias (CNA) si aparece en las células somáticas. [54] Una CNV o CNA podría deberse a una deleción o amplificación de un locus con respecto al número de copias del locus de referencia presentes en la célula y, en conjunto, son los principales contribuyentes a la variabilidad del genoma humano . [55] [56] [57] Se han asociado con cánceres; [58] [59] [60] enfermedades neurológicas, [61] psiquiátricas, [62] [63] y autoinmunes; [64] y reacciones adversas a los medicamentos. [65] Sin embargo, es difícil medir estas variaciones alélicas con alta precisión utilizando otros métodos como la qPCR, lo que dificulta las asociaciones fenotípicas y de enfermedades con el estado alterado de la NVC. [66] [67]
El gran número de mediciones de punto final "digitalizadas" que son posibles gracias a la partición de muestras permite que dPCR resuelva pequeñas diferencias en el número de copias con mayor exactitud y precisión en comparación con otros métodos como los microarrays basados en SNP [68] o qPCR. [69] [70] La qPCR tiene una capacidad limitada para cuantificar con precisión las amplificaciones de genes en varias enfermedades, incluida la enfermedad de Crohn, la infección por VIH-1 y la obesidad. [71] [67] [70]
La dPCR se diseñó para medir la concentración de un ácido nucleico diana en copias por unidad de volumen de la muestra. Cuando se opera en reacciones diluidas en las que menos del ~ 10% de las particiones contienen un objetivo deseado (denominado "dilución limitante"), el número de copias se puede estimar comparando el número de gotas fluorescentes que surgen de una NVC diana con el número de gotas fluorescentes. gotitas que surgen de un locus de referencia invariante de copia única. [22] De hecho, tanto en estas concentraciones objetivo más bajas como en las más altas donde múltiples copias del mismo objetivo pueden co-localizarse en una sola partición, las estadísticas de Poisson se utilizan para corregir estas múltiples ocupaciones para dar un valor más preciso para cada concentración del objetivo. [72] [73]
La PCR digital se ha utilizado para descubrir la variación somática y de la línea germinal en el número de copias de genes entre humanos [74] y para estudiar el vínculo entre la amplificación de HER2 (ERBB2) y la progresión del cáncer de mama . [75] [76] [77] [24]
Detección de mutaciones raras y alelos raros
La partición en PCR digital aumenta la sensibilidad y permite la detección de eventos raros, especialmente variantes de un solo nucleótido (SNV), al aislar o disminuir en gran medida la señal del biomarcador diana de un fondo potencialmente competitivo. [7] [5] Estos eventos se pueden organizar en dos clases: detección de mutaciones raras y detección de secuencias raras.
Detección de mutaciones raras
La detección de mutaciones raras se produce cuando existe un biomarcador dentro de un trasfondo de una contraparte muy abundante que difiere solo en una variante de un solo nucleótido (SNV). Se ha demostrado que la PCR digital es capaz de detectar ADN mutante en presencia de un exceso de 200.000 veces de fondo de tipo salvaje , que es 2.000 veces más sensible que lo que se puede lograr con la qPCR convencional. [7]
Detección de secuencias raras
La PCR digital puede detectar secuencias raras como el ADN del VIH en pacientes con VIH [21] y el ADN de bacterias fecales en el océano y otras muestras de agua para evaluar la calidad del agua. [78] La dPCR puede detectar secuencias tan raras como 1 de cada 1250 000 células. [21]
Biopsia líquida
La capacidad de dPCR para detectar mutaciones raras puede ser de particular beneficio en la clínica mediante el uso de la biopsia líquida , una estrategia generalmente no invasiva para detectar y monitorear enfermedades a través de fluidos corporales. [14] [79] Los investigadores han utilizado la biopsia líquida para controlar la carga tumoral, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer mediante la medición de mutaciones raras en el ADN tumoral circulante (ADNct) en una variedad de fluidos biológicos de pacientes que incluyen sangre , orina y líquido cefalorraquídeo. . [14] [80] [81] La detección temprana de ctDNA (como en la recaída molecular ) puede llevar a la administración más temprana de una inmunoterapia o una terapia dirigida específica para la firma de mutación del paciente, lo que potencialmente mejora las posibilidades de efectividad del tratamiento en lugar de esperar a que se realicen pruebas clínicas. recaída antes de alterar el tratamiento. Las biopsias líquidas pueden tener tiempos de respuesta de unos pocos días, en comparación con dos a cuatro semanas o más para las pruebas basadas en tejidos. [82] [83] Los médicos han utilizado este tiempo reducido para obtener resultados para acelerar los tratamientos adaptados a los datos de la biopsia . [82]
En 2016, un ensayo prospectivo con dPCR en el Dana-Farber Cancer Institute autenticó el beneficio clínico de la biopsia líquida como una herramienta de diagnóstico predictivo para pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas . [84] La aplicación de pruebas de biopsia líquidos también se han estudiado en pacientes con mama , [85] colorrectal , [86] [87] ginecológico , [88] y de la vejiga cánceres [80] [89] para supervisar tanto la carga de la enfermedad y la respuesta del tumor al tratamiento.
Expresión génica y cuantificación de ARN
Los estudios de expresión génica y cuantificación de ARN se han beneficiado de la mayor precisión y cuantificación absoluta de dPCR. [90] La cuantificación del ARN se puede realizar mediante RT-PCR , en la que el ARN se transcribe de forma inversa en ADNc en la propia reacción dividida, y el número de moléculas de ARN que se originan en cada transcrito (o transcrito alélico) se cuantifica mediante dPCR. [28]
A menudo, se puede lograr una mayor sensibilidad y precisión utilizando dPCR en lugar de qPCR para cuantificar moléculas de ARN, en parte porque no requiere el uso de una curva estándar para la cuantificación. [91] La dPCR también es más resistente a los inhibidores de la PCR para la cuantificación del ARN que la qPCR. [45] [13] [90]
dPCR puede detectar y cuantificar más especies objetivo individuales por canal de detección que qPCR en virtud de poder distinguir objetivos en función de su amplitud de fluorescencia diferencial o mediante el uso de combinaciones de colores distintivas para su detección. [92] [90] Como ejemplo de esto, se ha utilizado un sistema dPCR de 2 canales para detectar en un solo pozo la expresión de cuatro variantes de empalme diferentes de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana , una proteína que es más activa en la mayoría de las células tumorales. que en las células sanas. [93]
Usos alternativos para particiones
Utilizando las capacidades de partición dinámica empleadas en dPCR, se puede lograr una secuenciación de NGS mejorada mediante la partición de reacciones de PCR complejas antes de la amplificación para proporcionar una amplificación más uniforme en muchos amplicones distintos para el análisis de NGS . [94] [95] Además, se ha demostrado que la especificidad mejorada de las reacciones complejas de amplificación por PCR en gotitas reduce en gran medida el número de iteraciones necesarias para seleccionar aptámeros de alta afinidad en el método SELEX . [96] El particionamiento también puede permitir mediciones más sólidas de la actividad de la telomerasa de los lisados celulares. [97] [98] Las capacidades de partición dinámica de dPCR también se pueden usar para dividir miles de núcleos o células completas en gotitas individuales para facilitar la preparación de la biblioteca para un ensayo de una sola célula para cromatina accesible a transposasa usando secuenciación (scATAC-seq). [99]
PCR digital de gotitas
La PCR digital de gotas (ddPCR) es un método de dPCR en el que una reacción de muestra de 20 microlitros que incluye cebadores de ensayo y sondas Taqman o un tinte intercalante, se divide en gotas de aceite del tamaño de ~ 20.000 nanolitros mediante una técnica de emulsión de agua y aceite , termociclada para punto final en una placa de PCR de 96 pocillos y lectura de la amplitud de fluorescencia para todas las gotas en cada pocillo de muestra en un citómetro de flujo de gotas. [100]
Historia
La dPCR surgió de un enfoque publicado por primera vez en 1988 por Cetus Corporation cuando los investigadores demostraron que una sola copia del gen de la β-globina podía detectarse y amplificarse mediante PCR. [101] [102] Esto se logró diluyendo muestras de ADN de una línea celular humana normal con ADN de una línea mutante que tenía una deleción homocigótica del gen de la β-globina, hasta que ya no estaba presente en la reacción. En 1990, Peter Simmonds y AJ Brown utilizaron este concepto para cuantificar una molécula por primera vez. [103] Alex Morley y Pamela Sykes establecieron formalmente el método como técnica cuantitativa en 1992. [43]
En 1999, Bert Vogelstein y Kenneth Kinzler acuñaron el término "PCR digital" y demostraron que la técnica podría usarse para encontrar mutaciones raras del cáncer. [104] Sin embargo, la dPCR fue difícil de realizar; era intensivo en mano de obra, requería mucha capacitación para realizarlo correctamente y era difícil de realizar en grandes cantidades. [104] En 2003, Kinzler y Vogelstein continuaron refinando dPCR y crearon un método mejorado que llamaron tecnología BEAMing , un acrónimo de "perlas, emulsión, amplificación y magnetismo". El nuevo protocolo utilizó emulsión para compartimentar las reacciones de amplificación en un solo tubo. Este cambio hizo posible que los científicos escalaran el método a miles de reacciones en una sola ejecución. [105] [106] [107]
Las empresas que desarrollan sistemas comerciales de dPCR han integrado tecnologías como la partición automatizada de muestras, el recuento digital de los ácidos nucleicos y el aumento del recuento de gotas que pueden ayudar a que el proceso sea más eficiente. [108] [109] [110] En los últimos años, los científicos han desarrollado y comercializado diagnósticos basados en dPCR para varias afecciones, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el síndrome de Down . [111] [112] El primer sistema dPCR para uso clínico recibió la marca CE en 2017 y fue aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU . En 2019, para diagnosticar leucemia mieloide crónica . [113]
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enlaces externos
- Protocolo de PCR digital
- PCR cuantitativa de nanolitros de alto rendimiento
- La próxima frontera de PCR