Tecnología de arreglos de diversidad
Diversity Arrays Technology (DArT) es una técnica de marcador genético de alto rendimiento que puede detectar variaciones alélicas para proporcionar una cobertura completa del genoma sin ninguna información de secuencia de ADN para genotipado y otros análisis genéticos. [2] [1] [3] Los pasos generales implican reducir la complejidad del ADN genómico con enzimas de restricción específicas , elegir diversos fragmentos para que sirvan como representaciones de los genomas originales, amplificar a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), insertar fragmentos en un vector para ser colocado como sondas dentro de un microarreglo, luego se permitirá que los objetivos fluorescentes de una secuencia de referencia se hibriden con sondas y se sometan a un sistema de imágenes. [2] [1] El objetivo es identificar y cuantificar diversas formas de polimorfismo de ADN dentro del ADN genómico de las especies muestreadas. [2]
Informado por primera vez en 2001 por Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein y Kaiman Peng, DArT priorizó ventajas significativas sobre otros métodos tradicionales basados en cebadores, como la capacidad de analizar grandes cantidades de varias muestras a partir de una pequeña cantidad de ADN inicial. [2] [1] [4] [5] También proporcionó costos bajos y resultados más rápidos en comparación con matrices de ADN de estado sólido relacionadas que detectan polimorfismos de nucleótido único (SNP). [2] [1] Desde sus inicios, la tecnología ha sido un instrumento importante en el análisis de plantas poliploides , así como en la construcción de mapas físicos y genéticos.comprender las especies relacionadas en función de las similitudes y variaciones alélicas entre sus genomas. [2] [1] [6] [7] [8] [3]
El concepto fue desarrollado por primera vez por Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein y Kaiman Peng en 2001. [2] Su objetivo era establecer una técnica de detección y cuantificación de polimorfismo de ADN genómico que aumentara el rendimiento en comparación con métodos más tradicionales como la longitud de fragmento amplificado. polimorfismo (AFLP), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), repeticiones de secuencia simple (SSR). [2] [1] [4] [5] También tenían como objetivo minimizar el costo y la dependencia de genomas secuenciados para identificar polimorfismos que son una consecuencia de matrices de ADN de estado sólido inmovilizadas tempranas, como chips de ADN , que solo identifican SNP. [2] [1]Un subproducto de su descubrimiento de un método de perfilado de genoma completo rápido y de bajo costo fue que también proporcionó la identificación de SNP, así como inserciones, eliminaciones y cambios de pares de bases, que es una capa adicional de variación alélica entre especies. analizado. [2] [1]
Jaccoud, Kilian, Feinstein y Peng seleccionaron nueve subespecies de arroz como fuente para el análisis de polimorfismo y ADN genómico. [2] El análisis consistió en detectar la presencia o ausencia de polimorfismos de ADN específicos con matrices de sondeo y cuantificar la fuerza de cada señal, mediante fluorescencia, dentro de la subespecie. Al seleccionar y extraer muestras de ADN de los sujetos, las muestras se digirieron con tres enzimas de restricción específicas y se ligaron con ligasa T4. Después del ligamiento en ADN de doble cadena, se realizó la dilución y la extracción de una pequeña cantidad de mezcla para usar como molde de PCR. Los productos se colocaron en un vector pCR2.1-TOPO y posteriormente se transformaron en E . coli , quienes fueron seleccionados en base a su resistencia aampicilina y pigmentación de la interacción X-gal . [2] [1] Las células clonadas se amplifican con PCR, se purifican y se introducen en una micromatriz. El ADN de referencia y las muestras se mezclaron con colorantes fluorescentes, Cy3 o Cy5, se mezclaron, se desnaturalizaron y se permitieron hibridar para volver a introducirlos en la micromatriz para su posterior análisis. Los resultados informaron que el uso de DArT fue capaz de detectar la presencia o ausencia de polimorfismos de manera conveniente en comparación con RFLP, así como cuantificar los polimorfismos detectados. [2] Además, DArT pudo minimizar significativamente la cantidad de ADN inicial necesaria para realizar el análisis en comparación con otros métodos. [2]
El DArT se divide en tres pasos esenciales: reducción de la complejidad, representación genómica y ensayo DArT. [1]
