La transferencia oriental , o transferencia oriental , es una técnica bioquímica utilizada para analizar las modificaciones postraduccionales de las proteínas , incluida la adición de lípidos, fosfatos y glicoconjugados. Se utiliza con mayor frecuencia para detectar epítopos de carbohidratos . Por lo tanto, la transferencia oriental puede considerarse una extensión de la técnica bioquímica de la transferencia occidental . Se han descrito múltiples técnicas con el término "transferencia oriental (ting)", la mayoría utiliza proteína prospo transferida a partir de electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en un gel de fluoruro de polivinilideno o nitrocelulosamembrana. Las proteínas transferidas se analizan en busca de modificaciones postraduccionales utilizando sondas que pueden detectar lípidos , carbohidratos , fosforilación o cualquier otra modificación proteica. La transferencia oriental debe usarse para referirse a métodos que detectan sus objetivos a través de la interacción específica de las modificaciones postraduccionales y la sonda, distinguiéndolos de una transferencia occidental estándar . En principio, la transferencia oriental es similar a la transferencia de lectina (es decir, la detección de epítopos de carbohidratos en proteínas o lípidos). [1]
Historia y múltiples definiciones
La definición del término mancha oriental es algo confusa debido a que múltiples grupos de autores denominan un nuevo método como mancha oriental , o un derivado del mismo. Todas las definiciones son un derivado de la técnica de western blot desarrollada por Towbin en 1979. [2] Las definiciones actuales se resumen a continuación en el orden del primer uso del nombre; sin embargo, todos se basan en algunos trabajos anteriores. En algunos casos, la técnica había estado en práctica durante algún tiempo antes de la introducción del término.
- (1982) El término transferencia oriental fue rechazado específicamente por dos grupos separados: Reinhart y Malamud se refirieron a una transferencia de proteína de un gel nativo como una transferencia nativa ; [3] Peferoen et al., Optaron por referirse a su método para extraer proteínas separadas en gel de dodecilsulfato de sodio sobre nitrocelulosa usando un vacío como transferencia al vacío . [4] [5]
- (1984) La transferencia de Oriente Medio se ha descrito como una transferencia de poliA ARN (resuelto por agarosa) que luego se inmoviliza. El ARN inmovilizado luego se sondea usando ADN. [6]
- (1996) La transferencia Eastern-Western fue utilizada por primera vez por Bogdanov et al. [7] El método implicó la transferencia de fosfolípidos en la membrana de fluoruro de polivinilideno o nitrocelulosa antes de la transferencia de proteínas a la misma membrana de nitrocelulosa mediante transferencia occidental convencional y sondeo con anticuerpos específicos de conformación. Este método se basa en trabajos anteriores de Taki et al. en 1994, que originalmente denominaron transferencia TLC , [8] y se basó en un método similar introducido por Towbin en 1984. [9]
- (2000) La transferencia del Lejano Oriente parece haber sido nombrada por primera vez en 2000 por Ishikawa & Taki. [10] El método se describe con más detalle en el artículo sobre transferencia del Lejano Oriente , pero se basa en la tinción de anticuerpos o lectina de lípidos transferidos a membranas de fluoruro de polivinilideno.
- (2001) La transferencia Eastern se describió como una técnica para detectar glicoconjugados generados por transferencia de BSA sobre membranas de fluoruro de polivinilideno, seguido de tratamiento con peryodato. La proteína oxidada luego se trata con una mezcla compleja, generando un nuevo conjugado en la membrana. A continuación, se sondea la membrana con anticuerpos para los epítopos de interés. [11] Este método también ha sido discutido en trabajos posteriores del mismo grupo. [12] [13] El método es esencialmente transferencia del Lejano Oriente. [14]
- (2002) Eastern blot también se ha utilizado para describir una inmunotransferencia realizada en proteínas transferidas a una membrana de fluoruro de polivinilideno de un gel PAGE ejecutado con polaridad opuesta. [15] Dado que se trata esencialmente de una transferencia de Western , la inversión de carga se utilizó para denominar este método una transferencia de Eastern . [16] [17]
- (2005) Eastern blot se ha utilizado para describir una transferencia de proteínas en una membrana de fluoruro de polivinilideno donde la sonda es un aptámero en lugar de un anticuerpo. [18] Esto podría verse como similar a una transferencia Southern , sin embargo, la interacción es entre una molécula de ADN (el aptámero) y una proteína, en lugar de dos moléculas de ADN. [19] El método es similar a la mancha suroeste .
- (2006) Eastern blot se ha utilizado para referirse a la detección de proteínas de fusión mediante complementación. El nombre se basa en el uso de un activador enzimático (EA) como parte de la detección. [20] [21] [22]
- (2009) La transferencia oriental ha sido rebautizada más recientemente por Thomas et al. como una técnica que prueba proteínas transferidas a la membrana de fluoruro de polivinilideno con lectinas, toxina del cólera y tinciones químicas para detectar proteínas glicosiladas, lipoiladas o fosforiladas. [14] Estos autores distinguen el método de la mancha del Lejano Oriente nombrada por Taki et al. [10] en el sentido de que utilizan sondas de lectina y otros reactivos de tinción.
- (2009) Eastern blot se ha utilizado para describir una transferencia de proteínas en la membrana de nitrocelulosa donde la sonda es un aptámero en lugar de un anticuerpo. [23] El método es similar a la mancha suroeste.
- (2011) Un estudio reciente utilizó el término transferencia oriental para describir la detección de glicoproteínas con lectinas como la concanavalina A [24]
Claramente, no existe una única definición aceptada del término. Un artículo destacado reciente [25] ha entrevistado a Ed Southern , creador de la mancha Southern , con respecto a un nuevo bautizo de la mancha oriental de Tanaka et al. [12] El artículo compara la mancha oriental con "hadas, unicornios y un almuerzo gratis" y afirma que las manchas orientales "no existen". La mancha oriental se menciona en un libro de texto de inmunología que compara los métodos de transferencia comunes (sur, norte y oeste) y afirma que "la mancha oriental, sin embargo, solo existe en las preguntas de la prueba". [26]
Los principios utilizados para la transferencia oriental para detectar glucanos se remontan al uso de lectinas para detectar la glucosilación de proteínas . El primer ejemplo de este modo de detección es Tanner y Anstee en 1976, donde se utilizaron lectinas para detectar proteínas glicosiladas aisladas de eritrocitos humanos . [27] La detección específica de glicosilación a través de transferencia se denomina generalmente transferencia de lectina . H. Freeze ha proporcionado un resumen de las mejoras más recientes del protocolo. [1]
Aplicaciones
Una aplicación de la técnica incluye la detección de modificaciones de proteínas en dos especies bacterianas Ehrlichia : E. muris e IOE. La subunidad B de la toxina del cólera (que se une a los gangliósidos ), la concanavalina A (que detecta los glicanos que contienen manosa) y el nitrofosfomolibdato-verde de metilo (que detecta las fosfoproteínas) se utilizaron para detectar modificaciones de proteínas. La técnica mostró que las proteínas antigénicas de la E..muris no virulenta están más modificadas postraduccionalmente que la IOE altamente virulenta. [14]
Significado
La mayoría de las proteínas que se traducen a partir del ARNm experimentan modificaciones antes de volverse funcionales en las células. Estas modificaciones se conocen colectivamente como modificaciones postraduccionales . Las proteínas nacientes o plegadas, que son estables en condiciones fisiológicas, se someten luego a una batería de modificaciones catalizadas por enzimas específicas en las cadenas laterales o la columna vertebral.
Modificación post-traduccional de las proteínas puede incluir acetilación , acilación ( miristoilación , palmitoilación ), alquilación , arginilación , ADP-ribosilación , biotinilación , formilación , geranilgeranilación , glutamylation , glicosilación , glycylation , hidroxilación , isoprenilación , lipoilación , metilación , nitroalkylation , fosfopanteteinilación , fosforilación , prenilación , selenación , S-nitrosilación , succinilación , sulfatación , transglutaminación , sulfinilación , sulfonilación y ubiquitinación (sumoilación, neddyilación). [28] [29]
Las modificaciones postraduccionales que ocurren en el extremo N de la cadena de aminoácidos juegan un papel importante en la translocación a través de las membranas biológicas. Estos incluyen proteínas secretoras en procariotas y eucariotas y también proteínas que están destinadas a ser incorporadas en diversas membranas celulares y orgánulos como lisosomas , cloroplasto , mitocondrias y membranas plasmáticas . La expresión de proteínas postraducidas es importante en varias enfermedades.
Ver también
- Mancha del noroeste
Referencias
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