Eco RV (pronunciado "eco R cinco") es una endonucleasa de restricción de tipo IIaislada de ciertas cepas de Escherichia coli . Tiene el nombre alternativo Eco32I.
Endonucleasa de restricción EcoRV | ||||||||
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Identificadores | ||||||||
Símbolo | Endonuc-EcoRV | |||||||
Pfam | PF09233 | |||||||
InterPro | IPR015314 | |||||||
SCOP2 | 1sx5 / SCOPe / SUPFAM | |||||||
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En biología molecular , es una enzima de restricción de uso común . Crea extremos romos . La enzima reconoce la secuencia de ADN palindrómico de 6 bases 5'-GAT | ATC-3 'y forma un extremo romo en la línea vertical. [1]
La secuencia complementaria es entonces 3'-CTA | TAG-5 '. Los extremos son romos y se pueden ligar fácilmente en un sitio de clonación romo pero con menor eficacia que los extremos pegajosos.
Estructura
La estructura de esta enzima, y varios mutantes, en complejo con la secuencia de ADN que se corta ha sido resuelto por cristalografía de rayos X .
El núcleo de la enzima consiste en una hoja β mixta de cinco hebras flanqueada por hélices α. El núcleo se conserva en todas las demás endonucleasas de restricción de tipo II. También tiene un subdominio de dimerización N-terminal formado por una hélice α corta, una hoja antiparalela de dos hebras y una hélice α larga. Este subdominio se encuentra solo en EcoRV y PvuII. [2]
Modo de acción
Como EcoRI , EcoRV forma un homodímero en solución antes de unirse y actuar sobre su secuencia de reconocimiento . [3] Inicialmente, la enzima se une débilmente a un sitio no específico en el ADN. Camina aleatoriamente a lo largo de la molécula hasta que se encuentra el sitio de reconocimiento específico. [2] EcoRV tiene una alta especificidad por su secuencia de ADN diana.
La unión de la enzima induce un cambio conformacional en el ADN, doblándolo alrededor de 50 °. La flexión del ADN da como resultado el desapilamiento de las bases, el ensanchamiento del surco menor y la compresión del surco mayor. Esto hace que el enlace fosfodiéster se rompa más cerca del sitio activo de la enzima, donde se puede escindir. La escisión ocurre dentro de la secuencia de reconocimiento y no requiere hidrólisis de ATP. [2]
EcoRV es la única endonucleasa de restricción de tipo II que se sabe que provoca un cambio conformacional importante en el ADN inducido por proteínas. [2]
Usos
EcoRV se usa a menudo para cortar un vector plásmido para insertar un gen de interés durante la clonación de genes . La enzima es suministrada por muchos fabricantes y requiere albúmina de suero bovino para funcionar correctamente.
Ver también
Referencias
- ^ Schildkraut I, Banner CD, Rhodes CS, Parekh S (1984). "El sitio de escisión para la endonucleasa de restricción EcoRV es 5'-GAT / ATC". Gene . 27 (3): 327–329. doi : 10.1016 / 0378-1119 (84) 90078-7 .
- ^ a b c d Pingoud A, Jeltsch A (2001). "Estructura y función de las endonucleasas de restricción tipo II" . Investigación de ácidos nucleicos . 29 (18): 3705–3727. doi : 10.1093 / nar / 29.18.3705 . PMC 55916 . PMID 11557805 .
- ^ Bitinaite J, Wah DA, Aggarwal AK, Schildkraut I (1998). "La dimerización de FokI es necesaria para la escisión del ADN" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 (18): 10570-10575. Código bibliográfico : 1998PNAS ... 9510570B . doi : 10.1073 / pnas.95.18.10570 . PMC 27935 . PMID 9724744 .
- ^ Zahran, M., Daidone, I., Smith, JC y Imhof, P. (2010). Mecanismo de reconocimiento del ADN por la enzima de restricción EcoRV. Revista de Biología Molecular, 401 (3), 415-432.