La cristalografía electrónica es un método para determinar la disposición de los átomos en sólidos utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM).
Comparación con la cristalografía de rayos X
Puede complementar la cristalografía de rayos X para estudios de cristales muy pequeños (<0,1 micrómetros), tanto inorgánicos como orgánicos y de proteínas , como las proteínas de membrana , que no pueden formar fácilmente los grandes cristales tridimensionales necesarios para ese proceso. Las estructuras de las proteínas generalmente se determinan a partir de cristales bidimensionales (láminas o hélices ), poliedros como cápsides virales o proteínas individuales dispersas. Los electrones se pueden usar en estas situaciones, mientras que los rayos X no, porque los electrones interactúan con los átomos con más fuerza que los rayos X. Por lo tanto, los rayos X viajarán a través de un cristal delgado de 2 dimensiones sin difractar significativamente, mientras que los electrones se pueden usar para formar una imagen. Por el contrario, la fuerte interacción entre electrones y protones hace que los cristales gruesos (por ejemplo, tridimensionales> 1 micrómetro) sean impermeables a los electrones, que solo penetran distancias cortas.
Una de las principales dificultades de la cristalografía de rayos X es la determinación de fases en el patrón de difracción . Debido a la complejidad de las lentes de rayos X , es difícil formar una imagen del cristal que se difracta y, por lo tanto, se pierde la información de fase. Afortunadamente, los microscopios electrónicos pueden resolver la estructura atómica en el espacio real y la información de fase del factor de estructura cristalográfica se puede determinar experimentalmente a partir de la transformada de Fourier de una imagen. La transformada de Fourier de una imagen de resolución atómica es similar, pero diferente, a un patrón de difracción, con puntos reticulares recíprocos que reflejan la simetría y el espaciado de un cristal. [1] Aaron Klug fue el primero en darse cuenta de que la información de fase podía leerse directamente de la transformada de Fourier de una imagen de microscopía electrónica que había sido escaneada en una computadora, ya en 1968. Para esto, y sus estudios sobre estructuras de virus y transferencia de ARN, Klug recibió el Premio Nobel de Química en 1982.
Daño por radiación
Un problema común de la cristalografía de rayos X y la cristalografía electrónica es el daño por radiación , por el cual se dañan especialmente las moléculas orgánicas y las proteínas a medida que se obtienen imágenes, lo que limita la resolución que se puede obtener. Esto es especialmente problemático en el contexto de la cristalografía electrónica, donde el daño por radiación se concentra en muchos menos átomos. Una técnica utilizada para limitar el daño por radiación es la criomicroscopía electrónica , en la que las muestras se someten a criofijación y la formación de imágenes se realiza a temperaturas de nitrógeno líquido o incluso helio líquido . Debido a este problema, la cristalografía de rayos X ha tenido mucho más éxito en determinar la estructura de proteínas que son especialmente vulnerables al daño por radiación. El daño por radiación se investigó recientemente utilizando MicroED [2] [3] de cristales 3D delgados en un estado hidratado congelado.
Estructuras de proteínas determinadas por cristalografía electrónica
La primera estructura de proteína cristalográfica de electrones para lograr la resolución atómica fue la bacteriorrodopsina , determinada por Richard Henderson y sus colaboradores en el Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica en 1990. [4] Sin embargo, ya en 1975 Unwin y Henderson habían determinado la primera estructura de proteína de membrana en resolución intermedia (7 Ångström), que muestra por primera vez la estructura interna de una proteína de membrana, con sus hélices alfa perpendiculares al plano de la membrana. Desde entonces, se han determinado varias otras estructuras de alta resolución mediante cristalografía electrónica, incluido el complejo captador de luz , [5] el receptor nicotínico de acetilcolina , [6] y el flagelo bacteriano . [7] La estructura de proteína de mayor resolución resuelta por cristalografía electrónica de cristales 2D es la del canal de agua acuaporina -0. [8] En 2013, la cristalografía de electrones se extendió a cristales 3D mediante un nuevo método llamado difracción de electrones de microcristales , o MicroED. [2]
Aplicación a materiales inorgánicos.
Los estudios cristalográficos de electrones en cristales inorgánicos utilizando imágenes de microscopía electrónica de alta resolución (HREM) fueron realizados por primera vez por Aaron Klug en 1978 [9] y por Sven Hovmöller y colaboradores en 1984. [10] Se utilizaron imágenes HREM porque permiten seleccionar (por software de computadora) solo las regiones muy delgadas cercanas al borde del cristal para el análisis de la estructura (ver también procesamiento de imágenes cristalográficas ). Esto es de crucial importancia ya que en las partes más gruesas del cristal la función de onda de salida (que lleva la información sobre la intensidad y posición de las columnas de átomos proyectadas) ya no está relacionada linealmente con la estructura cristalina proyectada. Además, las imágenes HREM no solo cambian su apariencia al aumentar el grosor del cristal, sino que también son muy sensibles al ajuste elegido del desenfoque Δf de la lente del objetivo (consulte las imágenes HREM de GaN, por ejemplo). Para hacer frente a esta complejidad, Michael O'Keefe comenzó a principios de la década de 1970 a desarrollar un software de simulación de imágenes que permitía comprender e interpretar los cambios de contraste observados en las imágenes HREM. [11]
Hubo un serio desacuerdo en el campo de la microscopía electrónica de compuestos inorgánicos; mientras que algunos han afirmado que "la información de fase está presente en las imágenes EM", otros tienen la opinión opuesta de que "la información de fase se pierde en las imágenes EM". La razón de estos puntos de vista opuestos es que la palabra "fase" se ha utilizado con diferentes significados en las dos comunidades de físicos y cristalógrafos. Los físicos están más preocupados por la " fase de onda de electrones ", la fase de una onda que se mueve a través de la muestra durante la exposición de los electrones. Esta onda tiene una longitud de onda de aproximadamente 0.02-0.03 Ångström (dependiendo del voltaje de aceleración del microscopio electrónico). Su fase está relacionada con la fase del haz de electrones directo no difractado. Los cristalógrafos, por otro lado, se refieren a la "fase del factor de estructura cristalográfica " cuando simplemente dicen "fase". Esta fase es la fase de las ondas estacionarias de potencial en el cristal (muy similar a la densidad de electrones medida en la cristalografía de rayos X). Cada una de estas ondas tiene su longitud de onda específica, denominada valor d para la distancia entre los llamados planos de Bragg de potencial bajo / alto. Estos valores d van desde las dimensiones de la celda unitaria hasta el límite de resolución del microscopio electrónico, es decir, típicamente desde 10 o 20 Ångströms hasta 1 o 2 Ångströms. Sus fases están relacionadas con un punto fijo en el cristal, definido en relación con los elementos de simetría de ese cristal. Las fases cristalográficas son una propiedad del cristal, por lo que existen también fuera del microscopio electrónico. Las ondas de electrones desaparecen si se apaga el microscopio. Para determinar una estructura cristalina, es necesario conocer los factores de la estructura cristalográfica, pero no conocer las fases de la onda electrónica. En. [12] se puede encontrar una discusión más detallada sobre cómo las fases (factor de estructura cristalográfica) se vinculan con las fases de la onda electrónica. [12]
Al igual que con las proteínas, ha sido posible determinar las estructuras atómicas de los cristales inorgánicos mediante cristalografía electrónica. Para una estructura más simple, es suficiente usar tres vistas perpendiculares, pero para estructuras más complicadas, también pueden ser necesarias proyecciones hacia abajo de diez o más diagonales diferentes.
Además de las imágenes de microscopía electrónica, también es posible utilizar patrones de difracción de electrones (ED) para la determinación de la estructura cristalina. [13] [14] Se debe tener sumo cuidado para registrar tales patrones de ED de las áreas más delgadas para mantener la mayoría de las diferencias de intensidad relacionadas con la estructura entre las reflexiones (condiciones de difracción cuasi-cinemática). Al igual que con los patrones de difracción de rayos X, las fases importantes del factor de estructura cristalográfica se pierden en los patrones de difracción de electrones y deben descubrirse mediante métodos cristalográficos especiales como métodos directos , máxima probabilidad o (más recientemente) mediante el método de cambio de carga. Por otro lado, los patrones de DE de los cristales inorgánicos tienen a menudo una alta resolución (= espaciamientos interplanar con altos índices de Miller ) muy por debajo de 1 Ångström. Esto es comparable a la resolución puntual de los mejores microscopios electrónicos. En condiciones favorables, es posible utilizar patrones de DE desde una sola orientación para determinar la estructura cristalina completa. [15] Alternativamente, se puede usar un enfoque híbrido que usa imágenes HRTEM para resolver e intensidades de ED para refinar la estructura cristalina. [16] [17]
El progreso reciente para el análisis de estructuras por ED se logró mediante la introducción de la técnica de precesión Vincent-Midgley para registrar patrones de difracción de electrones. [18] Las intensidades así obtenidas suelen estar mucho más cerca de las intensidades cinemáticas, de modo que se pueden determinar incluso estructuras que están fuera de rango cuando se procesan datos de difracción de electrones convencionales (área seleccionada). [19] [20]
Se puede verificar la calidad de las estructuras cristalinas determinadas mediante cristalografía electrónica mediante el uso de cálculos de primeros principios dentro de la teoría funcional de la densidad (DFT). Este enfoque se aplicó por primera vez para la validación de varias estructuras ricas en metales que solo eran accesibles por HRTEM y ED, respectivamente. [21] [22]
Recientemente, se han determinado dos estructuras de zeolita muy complicadas mediante cristalografía de electrones combinada con difracción de rayos X en polvo. [23] [24] Estos son más complejos que las estructuras de zeolita más complejas determinadas por cristalografía de rayos X.
Referencias
- ^ R Hovden; Y Jiang; HL Xin; LF Kourkoutis (2015). "Reducción periódica de artefactos en transformadas de Fourier de imágenes de resolución atómica de campo completo". Microscopía y Microanálisis . 21 (2): 436–441. Código bibliográfico : 2015MiMic..21..436H . doi : 10.1017 / S1431927614014639 . PMID 25597865 .
- ^ a b Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew GW; Gonen, Tamir (3 de agosto de 2014). "Determinación de estructuras de alta resolución mediante recogida de datos de rotación continua en MicroED" . Métodos de la naturaleza . 11 (9): 927–930. doi : 10.1038 / nmeth.3043 . ISSN 1548-7091 . PMC 4149488 . PMID 25086503 .
- ^ Hattne, Johan; Shi, Dan; Glynn, Calina; Zee, Chih-Te; Gallagher-Jones, Marcus; Martynowycz, Michael W .; Rodríguez, José A .; Gonen, Tamir (2018). "Análisis de daños por radiación globales y específicos del sitio en Cryo-EM" . Estructura . 26 (5): 759–766.e4. doi : 10.1016 / j.str.2018.03.021 . ISSN 0969-2126 . PMC 6333475 . PMID 29706530 .
- ^ Henderson, R .; Baldwin, JM; Ceska, TA; Zemlin, F; Beckmann, E .; Downing, KH (junio de 1990). "Modelo para la estructura de bacteriorrodopsina basado en crio-microscopía electrónica de alta resolución". J Mol Biol . 213 (4): 899–929. doi : 10.1016 / S0022-2836 (05) 80271-2 . PMID 2359127 .
- ^ Kühlbrandt, Werner; Wang, Da Neng; Fujiyoshi, Yoshinori (febrero de 1994). "Modelo atómico del complejo de captación de luz vegetal por cristalografía electrónica". Naturaleza . 367 (6464): 614–21. Código Bibliográfico : 1994Natur.367..614K . doi : 10.1038 / 367614a0 . PMID 8107845 .
- ^ Miyazawa, Atsuo; Fujiyoshi, Yoshinori; Unwin, Nigel (junio de 2003). "Estructura y mecanismo de activación del poro del receptor de acetilcolina". Naturaleza . 423 (6943): 949–55. Bibcode : 2003Natur.423..949M . doi : 10.1038 / nature01748 . PMID 12827192 .
- ^ Yonekura, Koji; Maki-Yonekura, Saori; Namba, Keiichi (agosto de 2003). "Modelo atómico completo del filamento flagelar bacteriano por criomicroscopía electrónica". Naturaleza . 424 (6949): 643–50. Código bibliográfico : 2003Natur.424..643Y . doi : 10.1038 / nature01830 . PMID 12904785 .
- ^ Gonen, Tamir; Cheng, Yifan; Sliz, Piotr; Hiroaki, Yoko; Fujiyoshi, Yoshinori; Harrison, Stephen C .; Walz, Thomas (2005). "Interacciones lípido-proteína en cristales AQP0 bidimensionales de doble capa" . Naturaleza . 438 (7068): 633–638. Código Bibliográfico : 2005Natur.438..633G . doi : 10.1038 / nature04321 . ISSN 0028-0836 . PMC 1350984 . PMID 16319884 .
- ^ Klug, A (1978/79) Análisis y reconstrucción de imágenes en microscopía electrónica de macromoléculas biológicas Chemica Scripta vol 14, p. 245-256.
- ^ Hovmöller, Sven; Sjögren, Agneta; Farrants, George; Sundberg, Margareta; Marinder, Bengt-Olov (1984). "Posiciones atómicas precisas de microscopía electrónica". Naturaleza . 311 (5983): 238. Código bibliográfico : 1984Natur.311..238H . doi : 10.1038 / 311238a0 .
- ^ O'Keefe, MA; Buseck, PR; Iijima, S. (1978). "Imágenes de estructura cristalina computarizada para microscopía electrónica de alta resolución". Naturaleza . 274 (5669): 322. Bibcode : 1978Natur.274..322O . doi : 10.1038 / 274322a0 .
- ^ Zou, X (1999). "Sobre el problema de fase en microscopía electrónica: la relación entre factores de estructura, ondas de salida e imágenes HREM". Investigación y técnica de microscopía . 46 (3): 202-19. doi : 10.1002 / (SICI) 1097-0029 (19990801) 46: 3 <202 :: AID-JEMT4> 3.0.CO; 2-8 . PMID 10420175 .
- ^ BK Vainshtein (1964), Análisis de estructuras por difracción de electrones , Pergamon Press Oxford
- ^ DL Dorset (1995), Cristalografía de electrones estructurales , Plenum Publishing Corporation ISBN 0-306-45049-6
- ^ Weirich, TE; Zou, X; Ramlau, R; Simon, A; Cascarano, GL; Giacovazzo, C; Hovmöller, S (2000). "Estructuras de cristales de tamaño nanométrico determinadas a partir de datos de difracción de electrones de área seleccionada". Un Acta Crystallographica . 56 (Pt 1): 29–35. doi : 10.1107 / S0108767399009605 . PMID 10874414 .
- ^ Zandbergen, HW (1997). "Determinación de la estructura de partículas de Mg5Si6 en Al mediante estudios de difracción dinámica de electrones". Ciencia . 277 (5330): 1221-1225. doi : 10.1126 / science.277.5330.1221 .
- ^ Weirich, Thomas E .; Ramlau, Reiner; Simon, Arndt; Hovmöller, Sven; Zou, Xiaodong (1996). "Una estructura cristalina determinada con una precisión de 0,02 Å mediante microscopía electrónica". Naturaleza . 382 (6587): 144. Código bibliográfico : 1996Natur.382..144W . doi : 10.1038 / 382144a0 .
- ^ Difracción de electrones de precesión
- ^ Gemmi, M; Zou, X; Hovmöller, S; Migliori, A; Vennström, M; Andersson, Y (2003). "Estructura de Ti2P resuelta mediante datos de difracción de electrones tridimensionales recogidos con la técnica de precesión y microscopía electrónica de alta resolución". Acta Crystallographica . 59 (Parte 2): 117–26. doi : 10.1107 / S0108767302022559 . PMID 12604849 .
- ^ Weirich, T; Portillo, J; Cox, G; Hibst, H; Nicolopoulos, S (2006). "Determinación ab initio de la estructura del marco del óxido de metal pesado CsxNb2.54W2.46O14 a partir de datos de difracción de electrones de precesión de 100 kV". Ultramicroscopía . 106 (3): 164–75. doi : 10.1016 / j.ultramic.2005.07.002 . PMID 16137828 .
- ^ Albe, K; Weirich, TE (2003). "Estructura y estabilidad de alfa y beta-Ti2Se. Difracción de electrones frente a cálculos de teoría funcional de densidad". Un Acta Crystallographica . 59 (Pt 1): 18-21. doi : 10.1107 / S0108767302018275 . PMID 12496457 .
- ^ Weirich, TE (2004). "Cálculos de primeros principios como herramienta para la validación de estructuras en cristalografía electrónica". Un Acta Crystallographica . 60 (Parte 1): 75–81. Código bibliográfico : 2004AcCrA..60 ... 75W . doi : 10.1107 / S0108767303025042 . PMID 14691330 .
- ^ Gramm, Fabián; Baerlocher, Christian; McCusker, Lynne B .; Warrender, Stewart J .; Wright, Paul A .; Han, Bada; Hong, Suk Bong; Liu, Zheng; et al. (2006). "Estructura compleja de zeolita resuelta combinando difracción de polvo y microscopía electrónica". Naturaleza . 444 (7115): 79–81. Código Bibliográfico : 2006Natur.444 ... 79G . doi : 10.1038 / nature05200 . PMID 17080087 .
- ^ Baerlocher, C .; Gramm, F .; Massuger, L .; McCusker, LB; Él, Z .; Hovmoller, S .; Zou, X. (2007). "Estructura del catalizador de zeolita policristalina IM-5 resuelto por cambio de carga mejorada". Ciencia . 315 (5815): 1113–6. Código Bibliográfico : 2007Sci ... 315.1113B . doi : 10.1126 / science.1137920 . PMID 17322057 .
Otras lecturas
- Zou, XD, Hovmöller, S. y Oleynikov, P. "Cristalografía electrónica - Microscopía electrónica y difracción electrónica". IUCr Texts on Crystallography 16, Oxford University Press 2011. http://ukcatalogue.oup.com/product/9780199580200.doISBN 978-0-19-958020-0
- Downing, KH; Meisheng, H .; Wenk, H.-R .; O'Keefe, MA (1990). "Resolución de átomos de oxígeno en estaurolita por microscopía electrónica de transmisión tridimensional". Naturaleza . 348 (6301): 525–528. Código Bibliográfico : 1990Natur.348..525D . doi : 10.1038 / 348525a0 .
- Zou, XD; Hovmöller, S. (2008). "Cristalografía de electrones: imágenes y difracción monocristalina de polvos" . Un Acta Crystallographica . 64 : 149-160. Código Bibliográfico : 2008AcCrA..64..149Z . doi : 10.1107 / S0108767307060084 . PMID 18156680 .
- TE Weirich, XD Zou y JL Lábár (2006). Cristalografía electrónica: nuevos enfoques para la determinación de la estructura de materiales nanométricos . Springer Países Bajos, ISBN 978-1-4020-3919-5
enlaces externos
- Entrevista con Aaron Klug Premio Nobel por su trabajo en microscopía electrónica cristalográfica Video Freeview de Vega Science Trust.
- Raunser, S; Walz, T (2009). "Cristalografía electrónica como técnica para estudiar la estructura de las proteínas de membrana en un entorno lipídico". Revisión anual de biofísica . 38 (1): 89-105. doi : 10.1146 / annurev.biophys.050708.133649 . PMID 19416061 .