La criofijación es una técnica para la fijación o estabilización de materiales biológicos como primer paso en la preparación de muestras para microscopía electrónica y microscopía crioelectrónica . [1] Las muestras típicas para la criofijación incluyen pequeñas muestras de tejido vegetal o animal , suspensiones celulares de microorganismos o células cultivadas , suspensiones de virus o cápsides de virus y muestras de macromoléculas purificadas , especialmente proteínas . [2] [3]
Tipos de fijación criogénica
1.Secado por congelación
2.Sustitución por congelación
3.grabado por congelación
Congelación por inmersión
El método implica un enfriamiento ultrarrápido de muestras de células o tejidos pequeños a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ° C) o menos, deteniendo todo el movimiento y la actividad metabólica y preservando la estructura interna congelando todas las fases fluidas sólidas. Normalmente, una muestra se sumerge en nitrógeno líquido o en etano líquido o propano líquido en un recipiente enfriado con nitrógeno líquido. El objetivo final es congelar la muestra tan rápidamente (a 10 4 a 10 6 K por segundo) que los cristales de hielo no puedan formarse o se les impida crecer lo suficiente como para causar daño a la ultraestructura de la muestra . La formación de muestras que contienen especímenes en hielo amorfo es el " santo grial " de la criomicroscopía biológica. [ cita requerida ]
En la práctica, es muy difícil lograr velocidades de enfriamiento suficientemente altas para producir hielo amorfo en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor. Para ello, sumergir una muestra en nitrógeno líquido en su punto de ebullición (-196 ° C) [4] no siempre congela la muestra lo suficientemente rápido, por varias razones. Primero, el nitrógeno líquido hierve rápidamente alrededor de la muestra formando una película de N aislante.
2gas que ralentiza la transferencia de calor al líquido criogénico, conocido como efecto Leidenfrost . Las velocidades de enfriamiento se pueden mejorar bombeando nitrógeno líquido con una bomba de vacío de paletas rotativas durante algunas decenas de segundos antes de sumergir la muestra en ella. Esto reduce la temperatura del nitrógeno líquido por debajo de su punto de ebullición, de modo que cuando la muestra se sumerge en él, envuelve la muestra estrechamente durante un breve período de tiempo y extrae calor de ella de manera más eficiente. Se puede obtener un enfriamiento aún más rápido sumergiendo las muestras en propano líquido o etano (se ha encontrado que el etano es más eficiente) [5] enfriado muy cerca de sus puntos de fusión usando nitrógeno líquido [6] o golpeando la muestra contra nitrógeno líquido altamente pulido -Superficies metálicas refrigeradas de cobre o plata . [7] En segundo lugar, dos propiedades del agua evitan la rápida criofijación en muestras grandes. [8] La conductividad térmica del hielo es muy baja en comparación con la de los metales , y el agua libera calor latente de fusión a medida que se congela, derrotando el rápido enfriamiento en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor.
Congelación a alta presión
La alta presión ayuda a prevenir la formación de grandes cristales de hielo. La congelación rápida autopresurizada (SPRF) puede utilizar muchos criógenos diferentes y ha sido recientemente promocionada como una alternativa atractiva y de bajo costo a la congelación a alta presión (HPF). [9]
Referencias
- ^ Pilhofer, Martin; Ladinsky, Mark S .; McDowall, Alasdair W .; Jensen, Grant J. (2010). "TEM bacteriano". Métodos en biología celular . Métodos en biología celular. 96 : 21–45. doi : 10.1016 / S0091-679X (10) 96002-0 . ISBN 9780123810076. ISSN 0091-679X . PMID 20869517 .
- ^ Echlin P (1992). Microscopía y análisis de baja temperatura . Nueva York: Plenum Publishing Corporation.
- ^ Dubochet J, Adrian M, Chang JJ, Homo JC, Lepault J, McDowall AW, Schulz P (1988). "Microscopía crioelectrónica de muestras vitrificadas" (PDF) . Revisión trimestral de biofísica . 21 (2): 129-228. doi : 10.1017 / s0033583500004297 . PMID 3043536 .
- ^ Battersby BJ, Sharp JC, Webb RI, Barnes GT (1994). "Vitrificación de suspensiones acuosas de un entorno controlado para microscopía electrónica: un dispositivo de inmersión de enfriamiento mejorado". Revista de microscopía . 176 (2): 110-120. doi : 10.1111 / j.1365-2818.1994.tb03505.x .
- ^ Ryan, Keith P. (1992). "Criofijación de tejidos para microscopía electrónica: una revisión de los métodos de enfriamiento por inmersión" (PDF) . Escanear. Microsc . 6 (3): 715–743.
- ^ Bald WB (1984). "La eficacia relativa de los fluidos criogénicos utilizados en el enfriamiento rápido de muestras criogénicas". Revista de microscopía . 134 (3): 261–270. doi : 10.1111 / j.1365-2818.1984.tb02519.x .
- ^ Allison DP, Daw CS, Rorvik MC (1987). "La construcción y operación de un dispositivo de congelación de golpe simple y económico para microscopía electrónica". Revista de microscopía . 147 (Pt 1): 103–108. doi : 10.1111 / j.1365-2818.1987.tb02822.x . PMID 3305955 .
- ^ Bald WB (1987). Criofijación cuantitativa . Bristol y Filadelfia: Adam Hilger.
- ^ Leunissen Jan LM y Yi H. (2009). "Congelación rápida autopresurizada (SPRF): un nuevo método de criofijación para la preparación de muestras en microscopía electrónica" . J. Microsc . 235 (1): 25–35. doi : 10.1111 / j.1365-2818.2009.03178.x . PMID 19566624 . Archivado desde el original el 5 de enero de 2013.