Microcristales difracción de electrones , o MicroED , [1] [2] es un cryoEM método que fue desarrollado por el Gonen laboratorio a finales de 2013 en el Campus Janelia Investigación del Instituto Médico Howard Hughes . MicroED es una forma de cristalografía de electrones en la que se utilizan cristales 3D delgados para la determinación de la estructura mediante difracción de electrones .
El método se desarrolló para la determinación de la estructura de proteínas a partir de nanocristales que normalmente no son adecuados para la difracción de rayos X debido a su tamaño. Los cristales que son una mil millonésima parte del tamaño necesario para la cristalografía de rayos X pueden producir datos de alta calidad. [3] Las muestras se congelan hidratadas como para todas las demás modalidades CryoEM, pero en lugar de usar el microscopio electrónico de transmisión ( TEM ) en el modo de imagen, se usa en el modo de difracción con una exposición de electrones extremadamente baja (típicamente <0.01 e - / Å 2 / s). El nanocristal se expone al haz de difracción y se gira continuamente [2]mientras que la difracción se recoge en una cámara rápida como una película. [2] Los datos MicroED se procesan luego utilizando software tradicional para cristalografía de rayos X sin la necesidad de software especializado para análisis y refinamiento de estructuras. [4] Es importante destacar que tanto el hardware como el software utilizados en un experimento MicroED son estándar y están ampliamente disponibles.
Desarrollo
La primera demostración exitosa de MicroED fue reportada en 2013 por el laboratorio Gonen . [1] La estructura de la lisozima , una proteína de prueba clásica en cristalografía de rayos X . A principios de 2013, el grupo Abrahams informó de forma independiente datos de difracción de electrones en 3D utilizando un detector de área cuántica Medipix en cristales de lisozima, pero no pudo resolver la estructura debido a limitaciones técnicas. [5]
Configuración experimental
Se han publicado protocolos detallados para configurar el microscopio electrónico y para la recopilación de datos. [6]
Instrumentación
Microscopio
Los datos MicroED se recopilan mediante microscopía electrónica de transmisión (criogénica) . El microscopio debe estar equipado con una apertura de área seleccionada para usar la difracción de área seleccionada .
Detectores
Se ha utilizado una variedad de detectores para recopilar datos de difracción de electrones en experimentos MicroED. Se han utilizado detectores que utilizan dispositivos de carga acoplada (CCD) y tecnología complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS) . Con los detectores CMOS, se pueden interpretar los recuentos de electrones individuales. [7]
Recopilación de datos
Todavía difracción
La publicación inicial de prueba de concepto sobre MicroED utilizó cristales de lisozima. [1] Se recopilaron hasta 90 grados de datos de un solo nanocristal, con pasos discretos de 1 grado entre fotogramas. Cada patrón de difracción se recogió con una tasa de dosis ultrabaja de 0,01 e - / Å 2 / s. Los datos de 3 cristales se fusionaron para producir una estructura de resolución de 2,9 Å con buenas estadísticas de refinamiento, y representó la primera vez que la difracción de electrones se utilizó con éxito para determinar la estructura de una proteína sensible a la dosis a partir de microcristales 3D en condiciones criogénicas.
Rotación de escenario continua
Poco después del documento de prueba de principio, se mejoró MicroED aplicando rotación continua durante el esquema de recopilación de datos. [2] Aquí el cristal se gira lentamente en una sola dirección mientras la difracción se graba en una cámara rápida como una película. La metodología es como el método de rotación en cristalografía de rayos X. Esto condujo a varias mejoras en la calidad de los datos y permitió el procesamiento de datos utilizando software cristalográfico de rayos X estándar. [2] Los beneficios de la rotación continua MicroED incluyen una disminución en la dispersión dinámica y un muestreo mejorado del espacio recíproco. La rotación continua es el método estándar de recopilación de datos MicroED desde 2014.
Procesamiento de datos
Se han publicado protocolos detallados para el procesamiento de datos MicroED. [4] Cuando los datos MicroED se recopilan mediante la rotación continua de la etapa, se puede utilizar un software de cristalografía estándar .
Diferencias entre MicroED y otros métodos de difracción de electrones
Otros métodos de difracción de electrones que se han desarrollado para la ciencia de materiales de material insensible a la radiación, como las sales inorgánicas, incluyen la Tomografía de Difracción Automatizada (ADT) [8] y la Difracción de Electrones de Rotación (RED [9] ). Estos métodos difieren significativamente de MicroED: en ADT, los pasos discretos de inclinación del goniómetro se utilizan para cubrir el espacio recíproco en combinación con la precesión del haz para llenar los espacios. [8] ADT utiliza hardware especializado para microscopía electrónica de transmisión de barrido y precesión para el seguimiento de cristales. [8] ROJO se hace en TEM pero el goniómetro está inclinado en pasos discretos y la inclinación del haz se usa para llenar los espacios. [9] Se utiliza software especializado para procesar datos ADT y RED. [9] Es importante destacar que ADT y RED fueron desarrollados y probados en sales y materiales inorgánicos insensibles a la radiación y no se ha demostrado su uso con proteínas o material orgánico sensible a la radiación estudiado en un estado hidratado congelado.
Hitos
Alcance del método
MicroED se ha utilizado para determinar las estructuras de proteínas globulares grandes, [10] proteínas pequeñas, [2] péptidos, [11] proteínas de membrana, [12] moléculas orgánicas, [13] [14] y compuestos inorgánicos. [15] En muchos de estos ejemplos se observaron hidrógenos e iones cargados. [11] [12]
Nuevas estructuras de α-sinucleína de la enfermedad de Parkinson
Las primeras estructuras novedosas resueltas por MicroED se publicaron a finales de 2015. [11] Estas estructuras eran de fragmentos de péptidos que forman el núcleo tóxico de la α-sinculeína , la proteína responsable de la enfermedad de Parkinson y permiten conocer el mecanismo de agregación de los agregados tóxicos. Las estructuras se resolvieron con una resolución de 1,4 Å.
Nueva estructura proteica de R2lox
La primera estructura novedosa de una proteína resuelta por MicroED se publicó en 2019. [16] La proteína es la oxidasa de unión al ligando similar a la metaloenzima R2 (R2lox) de Sulfolobus acidocaldarius. La estructura se resolvió a una resolución de 3,0 Å mediante sustitución molecular utilizando un modelo de identidad de secuencia del 35% construido a partir del homólogo más cercano con una estructura conocida. Este trabajo demostró que MicroED podría usarse para obtener una estructura desconocida de proteína.
Acceso a educación y servicios MicroED
Para obtener más información sobre MicroED, se puede asistir al curso anual MicroED Imaging Center en UCLA o al curso MicroED en Diamond Light Source . Para obtener más información actualizada sobre las próximas reuniones y talleres relacionados con los métodos de microscopía electrónica criogénica en su conjunto, consulte la página de reuniones y talleres de 3DEM .
Varias universidades y empresas ofrecen servicios MicroED, incluido el MEDIC - Centro de imágenes por difracción de electrones de microcristales en UCLA y Servicios de nanoimagen .
Referencias
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Otras lecturas
- Antecedentes sobre MicroED de ThermoFisher Scientific, un importante productor de microscopios electrónicos de transmisión
- Entrevista en video sobre el desarrollo de MicroED y sus aplicaciones
- Los antecedentes de Janelia Archives en MicroED
- Antecedentes y publicaciones sobre MicroED del Laboratorio Gonen