Microscopía electrónica criogénica

La microscopía electrónica criogénica ( crio-EM ) es una técnica de microscopía electrónica (EM) que se aplica a muestras enfriadas a temperaturas criogénicas e incrustadas en un entorno de agua vítrea . Se aplica una solución de muestra acuosa a una rejilla y se congela por inmersión en etano líquido o una mezcla de etano líquido y propano. [2] Si bien el desarrollo de la técnica comenzó en la década de 1970, los avances recientes en tecnología de detectores y algoritmos de software han permitido la determinación de estructuras biomoleculares con una resolución casi atómica. [3] Esto ha atraído una gran atención al enfoque como una alternativa a la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN. para la determinación de la estructura macromolecular sin necesidad de cristalización.

Un microscopio electrónico de transmisión (2015).
Micrografía crioelectrónica del virus marino gigante CroV
(la barra de escala representa 200 nm) [1]

En 2017, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson "por desarrollar microscopía crioelectrónica para la determinación de estructuras de alta resolución de biomoléculas en solución". [4] Nature Methods también nombró a cryo-EM como el "Método del año" en 2016. [5]

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryo-TEM) es una técnica de microscopía electrónica de transmisión que se utiliza en biología estructural y ciencia de materiales .

  • Imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM) de una célula ARMAN intacta de una biopelícula de Iron Mountain. El ancho de la imagen es de 576 nm.

    • Desarrollo temprano

    En la década de 1960, el uso de la microscopía electrónica de transmisión para los métodos de determinación de estructuras estaba limitado debido al daño por radiación debido a los haces de electrones de alta energía. Los científicos plantearon la hipótesis de que examinar muestras a bajas temperaturas reduciría el daño por radiación inducida por el haz. [11] Tanto el helio líquido (−269 ° C o 4 K o −452,2 ° F ) como el nitrógeno líquido (−195,79 ° C o 77 K o −320 ° F ) se consideraron criógenos. En 1980, Erwin Knapek y Jacques Dubochet publicaron comentarios sobre el daño del rayo a temperaturas criogénicas compartiendo observaciones que:

    Se encontró que los cristales delgados montados en una película de carbono eran de 30 a 300 veces más resistentes al haz a 4 K que a temperatura ambiente ... La mayoría de nuestros resultados se pueden explicar asumiendo que la crioprotección en la región de 4 K depende en gran medida de la temperatura. [12]

    Sin embargo, estos resultados no fueron reproducibles y las enmiendas se publicaron en Nature solo dos años después informando que la resistencia del rayo era menos significativa de lo previsto inicialmente. La protección obtenida a 4 K estaba más cerca de "diez veces para muestras estándar de L-valina", [13] que lo que se dijo anteriormente.

    En 1981, Alasdair McDowall y Jacques Dubochet , científicos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular , informaron sobre la primera implementación exitosa de cryo-EM. [14] McDowall y Dubochet vitrificaron agua pura en una película delgada rociándola sobre una película de carbón hidrófilo que se sumergió rápidamente en criógeno ( propano líquido o etano líquido enfriado a 77 K). La fina capa de hielo amorfo tenía menos de 1 µm de espesor y un patrón de difracción de electrones confirmó la presencia de hielo amorfo / vítreo. En 1984, el grupo de Dubochet demostró el poder de la crio-EM en biología estructural con el análisis de adenovirus vitrificado tipo 2, bacteriófago T4 , virus Semliki Forest , bacteriófago CbK y virus de la estomatitis vesicular . [15]

    Premio Nobel de Química 2017

    En 2017, tres científicos, Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , recibieron el Premio Nobel de Química por desarrollar una técnica que tomaría imágenes de biomoléculas. [4]

    Rival potencial de la cristalografía de rayos X

    Hasta el 27 de octubre de 2020 , la cristalografía de rayos X se ha utilizado para obtener imágenes de 150 494 muestras biológicas y es la técnica dominante en microscopía biológica , con Cryo-EM muy por detrás con solo 6016. [16]

    Sin embargo, según Nature , los avances en los detectores de electrones directos (a menudo denominados dispositivos de detección directa o DDD) en la Universidad de Cambridge [17] y la automatización de la producción de muestras por SPT labtech [18] han llevado a un aumento en el uso en campos biológicos, [19] haciendo de Cryo-EM un rival potencial.

    La resolución de la cristalografía de rayos X está limitada por la pureza del cristal, [20] y la creación de estas muestras requiere mucho tiempo, hasta meses o incluso años. [19] Además, algunas proteínas son difíciles de cristalizar. [19] [21] Aunque la preparación de la muestra para Cryo-EM todavía es laboriosa, [22] no tiene estos problemas ya que observa la muestra en su “estado nativo”. [21]

    Según Proteopedia , la resolución mediana alcanzada por cristalografía de rayos X (al 19 de mayo de 2019) en el Protein Data Bank es 2.05 Å, [20] y la resolución más alta alcanzada en el registro (al 27 de octubre de 2020) es 0.48 UNA. [23] A partir de 2020, la mayoría de las estructuras de proteínas determinadas por Cryo-EM tienen una resolución más baja de 3-4 Å. [24] Sin embargo, las mejores resoluciones de Cryo-EM se acercan a 1,5 Å, [25] lo que lo convierte en un competidor justo en resolución en algunos casos.

    En 2019, se utilizaron luz correlativa Cryo-TEM y Cryo-ET para observar nanotubos tunelizados (TNT) en células neuronales. [26]

    La criomicroscopía electrónica de barrido (cryoSEM) es una técnica de microscopía electrónica de barrido con una etapa fría de un microscopio electrónico de barrido en una cámara criogénica.

    • Criofijación
    • Tomografía electrónica (ET)

    1. ^ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA y Suttle, CA (2017) "La reconstrucción de Cryo-EM de la cápside del virus Cafeteria roenbergensis sugiere una nueva ruta de ensamblaje para virus gigantes ". Scientific Reports , 7 : 5484. doi : 10.1038 / s41598-017-05824-w .
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