La disociación por transferencia de electrones ( ETD ) es un método de fragmentación de macromoléculas gaseosas con carga múltiple en un espectrómetro de masas entre las etapas de espectrometría de masas en tándem (MS / MS). [1] Similar a la disociación por captura de electrones , ETD induce la fragmentación de cationes grandes con carga múltiple transfiriéndoles electrones . [2] ETD se utiliza ampliamente con polímeros y moléculas biológicas como proteínas y péptidos para el análisis de secuencias . [3]La transferencia de un electrón provoca la escisión de la estructura del péptido en iones cyz mientras deja intactas las modificaciones postraduccionales (PTM) lábiles . [4] La técnica solo funciona bien para iones de péptidos o polímeros de estado de carga superior (z> 2). [2] Sin embargo, en relación con la disociación inducida por colisión (CID), la ETD es ventajosa para la fragmentación de péptidos más largos o incluso proteínas completas. [5] Esto hace que la técnica sea importante para la proteómica descendente . El método fue desarrollado por Hunt y sus compañeros de trabajo en la Universidad de Virginia . [6]
Historia
La disociación por captura de electrones (ECD) se desarrolló en 1998 para fragmentar proteínas grandes para el análisis espectrométrico de masas. [7] Debido a que ECD requiere una gran cantidad de electrones casi térmicos (<0.2eV), originalmente se usaba exclusivamente con la espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón de iones de transformada de Fourier (FTICR), la forma más cara de instrumentación de MS. [8] Las opciones menos costosas, como los instrumentos de tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF), trampa de iones cuadrupolo (QIT) y trampa de iones cuadrupolo lineal (QLT), utilizaban el método de disociación inducida por colisión (CID), que consumía más energía , resultando en una fragmentación aleatoria de péptidos y proteínas. [9] En 2004 Syka et al. anunció la creación de ETD, un método de disociación similar al ECD, pero utilizando un espectrómetro comercial de bajo costo y ampliamente disponible. Los primeros experimentos de ETD se realizaron en un espectrómetro de masas QLT con una fuente de ionización por electropulverización (ESI). [10]
Principio de funcionamiento
Varios pasos están involucrados en la disociación por transferencia de electrones. Por lo general, una mezcla de proteínas se separa primero mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). A continuación , se generan moléculas precursoras con protones múltiples mediante ionización por electropulverización y se inyectan en el espectrómetro de masas. (En ETD sólo se pueden usar moléculas con una carga de 2+ o más). Para que un electrón sea transferido a las moléculas precursoras positivas, se generan aniones radicales y se colocan en la trampa de iones con ellos. Durante la reacción ión / ión, se transfiere un electrón a la proteína o péptido con carga positiva, lo que provoca la fragmentación a lo largo de la estructura del péptido. Finalmente, los fragmentos resultantes se analizan en masa. [11]
Preparación de aniones radicales
En los experimentos originales de ETD, se utilizó antraceno (C 14 H 10 ) para generar aniones radicales reactivos mediante ionización química negativa . [10] En experimentos posteriores se han utilizado varias moléculas de hidrocarburos aromáticos policíclicos , siendo el fluoranteno el reactivo preferido en la actualidad. [12] Sin embargo, el fluoranteno tiene solo un 40% de eficiencia en la transferencia de electrones, por lo que se están buscando otras moléculas con baja afinidad electrónica. [11]
Inyección y fragmentación
Cuando los cationes precursores (proteínas o péptidos) y los aniones radicales se combinan en la trampa de iones, se transfiere un electrón al catión con carga múltiple. Esto forma un catión radical positivo inestable con una carga positiva menos y un electrón impar. [13] La fragmentación tiene lugar a lo largo de la columna vertebral del péptido en un enlace N-Cα, lo que da como resultado iones de fragmentos de tipo cy z. [14]
Análisis de masas
La fragmentación causada por ETD permite obtener información más completa sobre la secuencia de proteínas a partir de los espectros de ETD que a partir de la espectrometría de masas en tándem CID. Debido a que se detectan muchos iones de tipo c y z del esqueleto peptídico, se puede discernir una cobertura de secuencia casi completa de muchos péptidos a partir de los espectros de fragmentación de ETD. [15] Las secuencias de 15-40 aminoácidos tanto en el N-terminal como en el C-terminal de la proteína se pueden leer usando valores de masa a carga para los iones cargados simple y doblemente. Estas secuencias, junto con la masa medida de la proteína intacta, se pueden comparar con las entradas de la base de datos de proteínas conocidas y revelar modificaciones postraduccionales. [dieciséis]
Instrumentación
La disociación por transferencia de electrones tiene lugar en un espectrómetro de masas con trampa de iones con una fuente de ionización por electropulverización. Los primeros experimentos de ETD en la Universidad de Virginia utilizaron una trampa de iones lineales cuadrupolo de radiofrecuencia (LQT) modificada con una fuente de ionización química (CI) en la parte posterior del instrumento (ver diagrama a la derecha). [10] Debido a que se puede obtener un espectro en aproximadamente 300 milisegundos, la cromatografía líquida a menudo se combina con ETD MS / MS. [11] La desventaja de utilizar LQT es que el poder de resolución de masas es menor que el de otros espectrómetros de masas. [14]
Estudios posteriores han probado otros instrumentos para mejorar la resolución de masas. Tener una fuente de CI negativa en la parte posterior del instrumento interfería con el analizador de alta resolución en LQT-Orbitrap y el tiempo de vuelo cuadrupolo (QTOF), por lo que se han introducido métodos de ionización alternativos para los aniones radicales. [11]
En 2006, un grupo de la Universidad de Purdue dirigido por Scott McLuckey utilizó un espectrómetro de masas en tándem de cuadrupolo / tiempo de vuelo (QqTOF) con una fuente de ionización dual pulsada de nano-ESI / ionización química a presión atmosférica (APCI) utilizando aniones radicales de 1,3- dinitrobenceno como donante de electrones. [17] Más tarde, un laboratorio de la Universidad de Wisconsin adaptó un espectrómetro de masas de trampa de iones-trampa de iones lineales cuadrupolo híbrido para usar ETD. Este método también utilizó un método de ionización frontal para los aniones radicales del ácido 9-antracenocarboxílico a través de fuentes de ESI duales pulsadas. [18]
Dado que ETD es cada vez más popular para el análisis de estructuras de proteínas y péptidos, la implementación en espectrómetros de masas con trampa de iones fácilmente disponibles junto con analizadores de masas de alta resolución continúa evolucionando. [19]
Aplicaciones
Proteómica
ETD se usa ampliamente en el análisis de proteínas y péptidos grandes. Las modificaciones postraduccionales importantes que incluyen fosforilación , glicosilación y enlaces disulfuro se analizan todas usando ETD. [20]
Química de polímeros
Aunque los análisis de polímeros basados en MS se han realizado en gran medida utilizando MS de una sola etapa, la MS en tándem también se ha utilizado para caracterizar los componentes del polímero. La CID es el método de disociación más utilizado, pero la ETD se ha utilizado como método complementario. Las escisiones de unión únicas resultantes de ETD proporcionan información de diagnóstico valiosa. [2]
Ver también
- Disociación por transferencia de electrones negativa
- Espectrometría de masas en tándem
- Electropulverización
Referencias
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