Microscopio de fluorescencia

Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza fluorescencia en lugar de, o además de, dispersión , reflexión y atenuación o absorción , para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas . [1] [2] "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que usa fluorescencia para generar una imagen, ya sea una configuración simple como un microscopio de epifluorescencia o un diseño más complicado, como un microscopio confocal , que usa secciones ópticas para obtener mejor resolución de la imagen de fluorescencia. [3]

Un microscopio de fluorescencia vertical (Olympus BX61) con la torreta del cubo del filtro de fluorescencia sobre las lentes del objetivo, junto con una cámara digital.
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Principio de funcionamiento de los microscopios de fluorescencia y confocales

La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (o longitudes de onda) que es absorbida por los fluoróforos , lo que hace que emitan luz de longitudes de onda más largas (es decir, de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida mucho más débil mediante el uso de un filtro de emisión espectral. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son una fuente de luz ( la lámpara de arco de xenón o la lámpara de vapor de mercurio son comunes; las formas más avanzadas son los LED y láseres de alta potencia ), el filtro de excitación , el espejo dicroico (o divisor de haz dicroico ) y la emisión filtro (ver figura a continuación). Los filtros y el divisor de haz dicroico se eligen para que coincidan con las características de emisión y excitación espectral del fluoróforo utilizado para etiquetar la muestra. [1] De esta manera, la distribución de un solo fluoróforo (color) se visualiza a la vez. Las imágenes multicolores de varios tipos de fluoróforos deben componerse combinando varias imágenes de un solo color. [1]

La mayoría de los microscopios de fluorescencia en uso son microscopios de epifluorescencia, en los que la excitación del fluoróforo y la detección de la fluorescencia se realizan a través de la misma trayectoria de luz (es decir, a través del objetivo). Estos microscopios se utilizan ampliamente en biología y son la base para diseños de microscopios más avanzados, como el microscopio confocal y el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).

Microscopía de epifluorescencia

Esquema de un microscopio de fluorescencia.

La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los que se utilizan en las ciencias de la vida , tienen el diseño de epifluorescencia que se muestra en el diagrama. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través de la lente del objetivo . La fluorescencia emitida por la muestra es enfocada al detector por el mismo objetivo que se utiliza para la excitación que para mayor resolución necesitará lentes de objetivo con mayor apertura numérica . Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, solo la luz de excitación reflejada llega al objetivo junto con la luz emitida y, por lo tanto, el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal / ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro específico de longitud de onda, transmitiendo luz fluorescente a través del ocular o detector, pero reflejando cualquier luz de excitación restante hacia la fuente.

La microscopía de fluorescencia requiere una iluminación intensa, casi monocromática, que algunas fuentes de luz generalizadas, como las lámparas halógenas, no pueden proporcionar. [4] Se utilizan cuatro tipos principales de fuentes de luz, incluidas las lámparas de arco de xenón o las lámparas de vapor de mercurio con un filtro de excitación , láseres , fuentes de supercontinuo y LED de alta potencia . Los láseres se utilizan más ampliamente para técnicas de microscopía de fluorescencia más complejas como la microscopía confocal y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, mientras que las lámparas de xenón, las lámparas de mercurio y los LED con un filtro de excitación dicroico se usan comúnmente para microscopios de epifluorescencia de campo amplio. Colocando dos matrices de microlentes en la trayectoria de iluminación de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio, [5] se puede lograr una iluminación altamente uniforme con un coeficiente de variación del 1-2%.

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Animación 3D de la diatomea Corethron sp.
Muestra superposiciones de cuatro canales fluorescentes
(a) Verde: [DiOC6 (3) fluorescencia] - tiñe las membranas celulares indicando los cuerpos celulares centrales
(b) Cian: [fluorescencia PLL-A546] - contratinción genérica para visualizar superficies de células eucariotas
(c) Azul: [fluorescencia Hoechst] - tiñe el ADN, identifica los núcleos
(d) Rojo: [autofluorescencia de la clorofila] - resuelve los cloroplastos  [6]
La animación comienza superponiendo todos los canales fluorescentes disponibles y luego aclara la visualización activando y desactivando los canales.
Una muestra de esperma de arenque teñido con SYBR verde en una cubeta iluminada por luz azul en un microscopio de epifluorescencia. El verde SYBR de la muestra se une al ADN del esperma de arenque y, una vez unido, emite luz verde fluorescente cuando se ilumina con luz azul.

Para que una muestra sea adecuada para microscopía de fluorescencia, debe ser fluorescente. Existen varios métodos para crear una muestra fluorescente; las principales técnicas son el marcaje con tinciones fluorescentes o, en el caso de muestras biológicas, la expresión de una proteína fluorescente . Alternativamente, se puede usar la fluorescencia intrínseca de una muestra (es decir, autofluorescencia ). [1] En las ciencias de la vida, la microscopía de fluorescencia es una herramienta poderosa que permite la tinción específica y sensible de una muestra para detectar la distribución de proteínas u otras moléculas de interés. Como resultado, existe una amplia gama de técnicas para la tinción fluorescente de muestras biológicas.

Tinciones biológicas fluorescentes

Se han diseñado muchos tintes fluorescentes para una variedad de moléculas biológicas. Algunas de estas son moléculas pequeñas que son intrínsecamente fluorescentes y se unen a una molécula biológica de interés. Los principales ejemplos de estos son las tinciones de ácido nucleico como DAPI y Hoechst (excitados por luz de longitud de onda UV) y DRAQ5 y DRAQ7 (excitados óptimamente por luz roja) que se unen al surco menor del ADN , marcando así los núcleos de las células. Otros son fármacos, toxinas o péptidos que se unen a estructuras celulares específicas y se han derivatizado con un indicador fluorescente. Un ejemplo importante de esta clase de tinción fluorescente es la faloidina , que se utiliza para teñir fibras de actina en células de mamíferos . Un nuevo péptido, conocido como Péptido Hibridación de Colágeno , también se puede conjugar con fluoróforos y usarse para teñir fibras de colágeno desnaturalizadas . La tinción de las paredes de las células vegetales se realiza mediante tintes o tintes que se unen a la celulosa o la pectina . La búsqueda de sondas fluorescentes con una alta especificidad que también permitan la obtención de imágenes en vivo de células vegetales está en curso. [7]

Hay muchas moléculas fluorescentes llamadas fluoróforos o fluorocromos como la fluoresceína , Alexa Fluors o DyLight 488 , que pueden unirse químicamente a una molécula diferente que se une al objetivo de interés dentro de la muestra.

Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una técnica que utiliza la unión altamente específica de un anticuerpo a su antígeno para marcar proteínas específicas u otras moléculas dentro de la célula. Una muestra se trata con un anticuerpo primario específico para la molécula de interés. Un fluoróforo se puede conjugar directamente con el anticuerpo primario. Alternativamente , se puede usar un anticuerpo secundario , conjugado con un fluoróforo, que se une específicamente al primer anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo primario producido en un ratón que reconoce la tubulina combinada con un anticuerpo secundario anti-ratón derivatizado con un fluoróforo podría usarse para marcar microtúbulos en una célula.

Proteínas fluorescentes

La comprensión moderna de la genética y las técnicas disponibles para modificar el ADN permiten a los científicos modificar genéticamente las proteínas para llevar también un reportero de proteínas fluorescentes. En muestras biológicas, esto permite a un científico hacer fluorescente directamente una proteína de interés. La ubicación de la proteína se puede rastrear directamente, incluso en células vivas.

Los fluoróforos pierden su capacidad de emitir fluorescencia cuando se iluminan en un proceso llamado fotoblanqueo . El fotoblanqueo ocurre cuando las moléculas fluorescentes acumulan daño químico de los electrones excitados durante la fluorescencia. El fotoblanqueo puede limitar gravemente el tiempo durante el cual se puede observar una muestra mediante microscopía de fluorescencia. Existen varias técnicas para reducir el fotoblanqueo, como el uso de fluoróforos más robustos, minimizando la iluminación o utilizando productos químicos captadores fotoprotectores .

La microscopía de fluorescencia con proteínas indicadoras fluorescentes ha permitido el análisis de células vivas mediante microscopía de fluorescencia, sin embargo, las células son susceptibles a la fototoxicidad, particularmente con luz de longitud de onda corta. Además, las moléculas fluorescentes tienden a generar especies químicas reactivas cuando están bajo iluminación, lo que aumenta el efecto fototóxico.

A diferencia de las técnicas de microscopía de luz transmitida y reflejada, la microscopía de fluorescencia solo permite la observación de las estructuras específicas que han sido marcadas para fluorescencia. Por ejemplo, observar una muestra de tejido preparada con una tinción de ADN fluorescente mediante microscopía de fluorescencia solo revela la organización del ADN dentro de las células y no revela nada más sobre las morfologías celulares.

Las técnicas computacionales que proponen estimar la señal fluorescente de imágenes no fluorescentes (como campo claro) pueden reducir estas preocupaciones [8] . En general, estos enfoques implican entrenar una red neuronal convolucional profunda en células teñidas y luego estimar la fluorescencia en muestras no teñidas. Por lo tanto, al desacoplar las células bajo investigación de las células utilizadas para entrenar la red, la formación de imágenes se puede realizar más rápido y con una fototoxicidad reducida.

La naturaleza ondulatoria de la luz limita el tamaño del punto al que se puede enfocar la luz debido al límite de difracción . Esta limitación fue descrita en el siglo XIX por Ernst Abbe y "limita la resolución de un microscopio óptico a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada". La microscopía de fluorescencia es fundamental para muchas técnicas que tienen como objetivo superar este límite mediante configuraciones ópticas especializadas.

Se han inventado varias mejoras en las técnicas de microscopía en el siglo XX y han dado como resultado una mayor resolución y contraste hasta cierto punto. Sin embargo, no superaron el límite de difracción. En 1978 se desarrollaron las primeras ideas teóricas para romper esta barrera utilizando un microscopio 4Pi como microscopio de fluorescencia de escaneo láser confocal donde la luz se enfoca idealmente desde todos los lados a un foco común que se utiliza para escanear el objeto por 'punto por- excitación de punto 'combinada con detección' punto por punto '. [9] Sin embargo, la primera demostración experimental del microscopio 4pi tuvo lugar en 1994. [10] La microscopía 4Pi maximiza la cantidad de direcciones de enfoque disponibles mediante el uso de dos lentes de objetivo opuestos o microscopía de excitación de dos fotones con luz corrida al rojo y excitación de fotones múltiples .

La microscopía correlativa integrada combina un microscopio de fluorescencia con un microscopio electrónico. Esto permite visualizar la ultraestructura y la información contextual con el microscopio electrónico mientras se utilizan los datos del microscopio de fluorescencia como herramienta de etiquetado. [11]

La primera técnica para lograr realmente una resolución de sub-difracción fue la microscopía STED , propuesta en 1994. Este método y todas las técnicas que siguen el concepto RESOLFT se basan en una fuerte interacción no lineal entre la luz y las moléculas fluorescentes. Las moléculas son impulsadas fuertemente entre estados moleculares distinguibles en cada ubicación específica, de modo que finalmente la luz se puede emitir en solo una pequeña fracción del espacio, por lo tanto, una mayor resolución.

También en la década de 1990 se desarrolló otro método de microscopía de súper resolución basado en microscopía de campo amplio. Se logró una resolución de tamaño sustancialmente mejorada de nanoestructuras celulares teñidas con un marcador fluorescente mediante el desarrollo de microscopía de localización SPDM y la iluminación láser estructurada (iluminación modulada espacialmente, SMI). [12] La combinación del principio de SPDM con SMI dio como resultado el desarrollo del microscopio Vertico SMI . [13] [14] La detección de una sola molécula de colorantes fluorescentes parpadeantes normales como la proteína verde fluorescente (GFP) se puede lograr mediante un mayor desarrollo de SPDM, la denominada tecnología SPDMphymod, que permite detectar y contar dos tipos de moléculas fluorescentes diferentes. a nivel molecular (esta tecnología se conoce como microscopía de localización de dos colores o 2CLM). [15]

Alternativamente, el advenimiento de la microscopía de localización fotoactivada podría lograr resultados similares confiando en el parpadeo o el cambio de moléculas individuales, donde la fracción de moléculas fluorescentes es muy pequeña en cada momento. Esta respuesta estocástica de las moléculas sobre la luz aplicada corresponde también a una interacción altamente no lineal que conduce a la resolución de la subdifracción.

  • Proyección z de una célula de osteosarcoma, teñida con faloidina para visualizar filamentos de actina. La imagen se tomó en un microscopio confocal y la deconvolución posterior se realizó utilizando una función de dispersión puntual derivada experimentalmente.

  • Imágenes epifluorescentes de los tres componentes de una célula cancerosa humana en división. El ADN está teñido de azul, una proteína llamada INCENP es verde y los microtúbulos son rojos. Se obtienen imágenes de cada fluoróforo por separado usando una combinación diferente de filtros de excitación y emisión, y las imágenes se capturan secuencialmente usando una cámara CCD digital , luego se superponen para dar una imagen completa.

  • Células endoteliales bajo el microscopio. Los núcleos se tiñen de azul con DAPI, los microtúbulos se marcan en verde por un anticuerpo unido a FITC y los filamentos de actina se marcan en rojo con faloidina unida a TRITC. Células endoteliales de la arteria pulmonar bovina (BPAE)

  • Microscopía 3D de superresolución de dos colores con Her2 y Her3 en células mamarias, colorantes estándar: Alexa 488, Alexa 568. Microscopía LIMON

  • Núcleo de linfocitos humanos teñido con DAPI con sondas de centrómero del cromosoma 13 (verde) y 21 (rojo) hibridadas (hibridación fluorescente in situ (FISH))

  • Membrana de células de levadura visualizada por algunas proteínas de membrana fusionadas con marcadores fluorescentes RFP y GFP. La imposición de luz de ambos marcadores da como resultado un color amarillo.

  • Microscopía de súper resolución: detección de una sola molécula de YFP en una célula cancerosa humana. Mediciones de distancia típicas en el rango de 15 nm medidas con un microscopio Vertico-SMI / SPDMphymod

  • Microscopía de súper resolución: microscopía de co-localización (2CLM) con proteínas de fusión GFP y RFP (núcleo de una célula de cáncer de hueso) 120.000 moléculas localizadas en un área de campo amplio (470 µm 2 ) medidas con un microscopio Vertico-SMI / SPDMphymod

  • La microscopia de fluorescencia de Expresión de ADN en el ser humano de tipo salvaje y mutante P239S Palladin .

  • Imágenes de microscopía de fluorescencia de patología de llamaradas solares en un glóbulo que muestra las áreas afectadas en rojo.

  • Imágenes de fluorescencia
  • Fluorescencia en las ciencias de la vida
  • Microscopía correlativa de luz y electrones
  • Elizabeth Harry , pionera en técnicas de microscopía de fluorescencia para la visualización de proteínas subcelulares bacterianas
  • Proteína verde fluorescente (GFP)
  • Lámpara de vapor de mercurio
  • Microscopio
  • Microscopio electrónico de barrido # Catodoluminiscencia
  • Cambio de Stokes
  • Lámpara de arco de xenón

  1. ^ a b c d Spring KR, Davidson MW. "Introducción a la microscopía de fluorescencia" . Microscopía NikonU . Consultado el 28 de septiembre de 2008 .
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  • Fluorophores.org [ enlace muerto permanente ] , la base de datos de tintes fluorescentes
  • Centro de recursos de microscopía
  • animaciones y explicaciones sobre varios tipos de microscopios, incluidos microscopios fluorescentes y confocales (Université Paris Sud)