Un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total ( TIRFM ) es un tipo de microscopio con el que se puede observar una región delgada de una muestra, generalmente de menos de 200 nanómetros .
Fondo
En biología celular y molecular , se han estudiado con microscopios de fluorescencia convencionales un gran número de eventos moleculares en las superficies celulares, como la adhesión celular , la unión de células por hormonas , la secreción de neurotransmisores y la dinámica de membranas . Sin embargo, los fluoróforos que están unidos a la superficie de la muestra y los del medio circundante existen en un estado de equilibrio . Cuando estas moléculas se excitan y detectan con un microscopio de fluorescencia convencional, la fluorescencia resultante de los fluoróforos unidos a la superficie a menudo se ve abrumada por la fluorescencia de fondo debido a la población mucho mayor de moléculas no unidas. TIRFM permite la excitación selectiva de los fluoróforos unidos a la superficie, mientras que las moléculas no unidas no se excitan y no emiten fluorescencia. Debido al hecho de la selectividad de la superficie submicrométrica, TIRFM se ha convertido en un método de elección para la detección de una sola molécula.
Descripción general
La idea de utilizar la reflexión interna total para iluminar las células que entran en contacto con la superficie del vidrio fue descrita por primera vez por EJ Ambrose en 1956. [1] Esta idea luego fue ampliada por Daniel Axelrod [2] en la Universidad de Michigan, Ann Arbor a principios de la década de 1980. como TIRFM. Un TIRFM utiliza una onda evanescente para iluminar y excitar selectivamente los fluoróforos en una región restringida de la muestra inmediatamente adyacente a la interfaz vidrio-agua. El campo electromagnético evanescente decae exponencialmente desde la interfaz y, por lo tanto, penetra hasta una profundidad de solo aproximadamente 100 nm en el medio de muestra. Por tanto, el TIRFM permite una visualización selectiva de las regiones de la superficie, como la membrana plasmática basal (que tiene un grosor de aproximadamente 7,5 nm) de las células, como se muestra en la figura anterior. Sin embargo, tenga en cuenta que la región visualizada tiene al menos unos pocos cientos de nanómetros de ancho, por lo que la zona citoplásmica inmediatamente debajo de la membrana plasmática se visualiza necesariamente además de la membrana plasmática durante la microscopía TIRF. La visualización selectiva de la membrana plasmática muestra las características y eventos de la membrana plasmática en células vivas con alta resolución axial .
TIRF también se puede utilizar para observar la fluorescencia de una sola molécula , [3] [4] por lo que es una herramienta importante de biofísica y biología cuantitativa. La microscopía TIRF también se ha aplicado en la detección de moléculas individuales de biomarcadores de ADN y la discriminación de SNP. [5]
Se ha demostrado que la geometría cis (TIRFM a través del objetivo) y la geometría trans (TIRFM basada en prismas y guías de luz) proporcionan una calidad diferente del efecto de la reflexión interna total. En el caso de la transgeometría, la trayectoria de la luz de excitación y el canal de emisión están separados, mientras que en el caso del TIRFM de tipo objetivo comparten el objetivo y otros elementos ópticos del microscopio. Se demostró que la geometría basada en prismas genera una onda evanescente limpia, cuya desintegración exponencial se acerca a la función teóricamente predicha. [6] En el caso de TIRFM basado en objetivos, sin embargo, la onda evanescente está contaminada con intensa luz parásita . Se demostró que la intensidad de la luz parásita asciende al 10-15% de la onda evanescente, lo que dificulta la interpretación de los datos obtenidos por TIRFM de tipo objetivo [7] [8]
Referencias
- ^ Ambrose, EJ (24 de noviembre de 1956). "Un microscopio de contacto de superficie para el estudio de los movimientos celulares". Naturaleza . 178 (4543): 1194. Bibcode : 1956Natur.178.1194A . doi : 10.1038 / 1781194a0 . PMID 13387666 . S2CID 4290898 .
- ^ Axelrod, D. (1 de abril de 1981). "Contactos célula-sustrato iluminados por fluorescencia de reflexión interna total" . The Journal of Cell Biology . 89 (1): 141-145. doi : 10.1083 / jcb.89.1.141 . PMC 2111781 . PMID 7014571 .
- ^ Yanagida, Toshio; Sako, Yasushi; Minoghchi, Shigeru (10 de febrero de 2000). "Imágenes de una sola molécula de señalización de EGFR en la superficie de las células vivas". Biología celular de la naturaleza . 2 (3): 168-172. doi : 10.1038 / 35004044 . PMID 10707088 . S2CID 25515586 .
- ^ Andre y col. El tirf / afm con correlación cruzada revela una distribución asimétrica de cabezas generadoras de fuerza a lo largo de filamentos sintéticos de miosina autoensamblados. Biophysical Journal, 96: 1952-1960, 2009.
- ^ Sapkota, K .; et al. (2019). "Detección basada en FRET de un solo paso de ADN de Femtomoles" . Sensores . 19 (16): 3495. doi : 10.3390 / s19163495 . PMID 31405068 .
- ^ Ambrose, W; et al. (1999). "Detección de una sola molécula con excitación de reflexión interna total: comparación de señal a fondo y señales totales en diferentes geometrías". Citometría . 36 (3): 224–31. doi : 10.1002 / (sici) 1097-0320 (19990701) 36: 3 <224 :: aid-cyto12> 3.0.co; 2-j . PMID 10404972 .
- ^ Mattheyses A. y Axelrod, D. (2006). "Medición directa del perfil de campo evanescente producido por TIRF basado en objetivos". J Biomed Opt . 11 : 014006A. doi : 10.1117 / 1.2161018 . PMID 16526883 .
- ^ Brunstein M, Teremetz M, Hérault K, Tourain C, Oheim, M. (2014). "Eliminación de la excitación de campo lejano no deseada en TIRF de tipo objetivo. Parte I." Biophys. J . 106 (5): 1020. Bibcode : 2014BpJ ... 106.1020B . doi : 10.1016 / j.bpj.2013.12.049 . PMC 4026778 . PMID 24606927 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- Axelrod, Daniel (1 de noviembre de 2001). "Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total en biología celular" (PDF) . Tráfico . 2 (11): 764–774. doi : 10.1034 / j.1600-0854.2001.21104.x . hdl : 2027,42 / 72779 . PMID 11733042 . S2CID 15202097 .
enlaces externos
- Base de datos interactiva de tintes y filtros de fluorescencia Carl Zeiss Base de datos interactiva de tintes y filtros de fluorescencia.
- Microscopía TIRF: Introducción y aplicaciones Tutorial TIRF de Microscopy U
- Microscopía TIRF: Tutorial general de TIRF del Centro de recursos de microscopía de Olympus
- Microscopios TIRFM de Olympus sistemas de microscopios TIRF comerciales
- Sistemas de microscopios TIRF comerciales Carl Zeiss Laser TIRF 3
- Microscopía TIRF basada en guía de luz y prisma TIRF-Labs.com: Microscopía y espectroscopía TIRF comercial. Selección de geometría TIRFM para su aplicación
- Microscopía TIRF FLIM Lambert Instruments TIRF - Microscopía FLIM
- Schwartz Research Group, CU-Boulder Single Molecule Imaging Research Group