El bromuro de etidio (o bromuro de homidio , [2] sal de cloruro de cloruro de homidio ) [3] [4] es un agente intercalante comúnmente utilizado como etiqueta fluorescente ( tinción de ácido nucleico ) en laboratorios de biología molecular para técnicas como la electroforesis en gel de agarosa . Comúnmente se abrevia como EtBr , que también es una abreviatura de bromoetano . Para evitar confusiones, algunos laboratorios han utilizado la abreviatura EthBr para esta sal. Cuando se expone a la luz ultravioleta , seemite fluorescencia con un color naranja, intensificándose casi 20 veces después de unirse al ADN . Bajo el nombre de homidium , se ha utilizado comúnmente desde la década de 1950 en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado. [5] La alta incidencia de resistencia a los antimicrobianos hace que este tratamiento no sea práctico en algunas áreas, donde en su lugar se usa el cloruro de isometamidio relacionado . Varios comentaristas científicos han alegado que el bromuro de etidio es seguro. [6]
Como ocurre con la mayoría de los compuestos fluorescentes , el bromuro de etidio es aromático . Su resto heterocíclico central se conoce genéricamente como fenantridina , un isómero del cual es el colorante fluorescente acridina . Los máximos de absorción de EtBr en solución acuosa son a 210 nm y 285 nm, que corresponden a la luz ultravioleta . Como resultado de esta excitación , el EtBr emite una luz naranja con una longitud de onda de 605 nm. [7] [8]
La intensa fluorescencia del bromuro de etidio después de la unión con el ADN probablemente no se deba a la estabilización rígida del resto fenilo , porque se ha demostrado que el anillo de fenilo se proyecta fuera de las bases intercaladas. De hecho, se encuentra que el grupo fenilo es casi perpendicular al plano del sistema de anillos, ya que gira alrededor de su enlace simple para encontrar una posición en la que incida mínimamente sobre el sistema de anillos. En cambio, se cree que el ambiente hidrofóbico que se encuentra entre los pares de bases es el responsable . Al pasar a este entorno hidrofóbico y alejarse del solvente, el catión etidio se ve obligado a desprenderse de cualquier molécula de agua que estuviera asociada con él. Como el agua es una fluorescencia altamente eficienteextintor , la eliminación de estas moléculas de agua permite que el etidio emita fluorescencia. [ cita requerida ]
El bromuro de etidio se usa comúnmente para detectar ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular. En el caso del ADN, este suele ser ADN bicatenario procedente de PCR , digestiones de restricción , etc. También se puede detectar ARN monocatenario , ya que normalmente se pliega sobre sí mismo y, por lo tanto, proporciona un apareamiento local de bases para que el colorante se intercale. La detección generalmente involucra un gel que contiene ácidos nucleicos colocado sobre o debajo de una lámpara ultravioleta. Dado que la luz ultravioleta es dañina para los ojos y la piel, los geles teñidos con bromuro de etidio generalmente se ven indirectamente usando una cámara cerrada, con el fluorescenteimágenes registradas como fotografías. Cuando se necesite una visualización directa, se deben proteger los ojos del espectador y la piel expuesta. En el laboratorio, las propiedades de intercalación se han utilizado durante mucho tiempo para minimizar la condensación cromosómica cuando un cultivo se expone a agentes inhibidores de la mitosis durante la recolección. Las preparaciones de portaobjetos resultantes permiten un mayor grado de resolución y, por lo tanto, más confianza en la determinación de la integridad estructural de los cromosomas en el análisis microscópico.
El bromuro de etidio también se utiliza durante la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa . [9] Se agrega al tampón de ejecución y se une al intercalar entre pares de bases de ADN. Cuando el gel de agarosa se ilumina con luz ultravioleta, las bandas de ADN se vuelven visibles. La intercalación de EtBr puede alterar las propiedades de la molécula de ADN, como la carga, el peso, la conformación y la flexibilidad. Dado que las movilidades de las moléculas de ADN a través del gel de agarosa se miden en relación con un patrón de peso molecular, los efectos del EtBr pueden ser fundamentales para determinar el tamaño de las moléculas. [10]