La fluorescencia se utiliza en las ciencias de la vida generalmente como una forma no destructiva de rastrear o analizar moléculas biológicas por medio de la fluorescencia. Algunas proteínas o moléculas pequeñas en las células son naturalmente fluorescentes, lo que se denomina fluorescencia intrínseca o autofluorescencia (como NADH , triptófano o clorofila endógena , ficoeritrina o proteína verde fluorescente ). Alternativamente, las proteínas específicas o generales, los ácidos nucleicos , los lípidos o las moléculas pequeñas se pueden "marcar" con un fluoróforo extrínseco , un tinte fluorescenteque puede ser una molécula pequeña, una proteína o un punto cuántico . Existen varias técnicas para explotar propiedades adicionales de los fluoróforos , como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , en la que la energía pasa de forma no radiativa a un colorante vecino particular, lo que permite detectar la proximidad o la activación de proteínas; otro es el cambio de propiedades, como la intensidad, de ciertos tintes en función de su entorno permitiendo su uso en estudios estructurales. [1] [2] [3]
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Fluorescencia
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El principio detrás de la fluorescencia es que la fracción fluorescente contiene electrones que pueden absorber un fotón y entrar brevemente en un estado excitado antes de dispersar la energía de forma no radiativa o emitirla como un fotón , pero con una energía menor, es decir, a una longitud de onda más larga ( la longitud de onda y la energía son inversamente proporcionales). [4] La diferencia en las longitudes de onda de excitación y emisión se denomina desplazamiento de Stokes , y el tiempo que tarda un electrón excitado en emitir el fotón se denomina vida útil . El rendimiento cuántico es un indicador de la eficiencia del tinte (es la proporción de fotones emitidos por fotón absorbido) y el coeficiente de extinción es la cantidad de luz que puede ser absorbida por un fluoróforo. Tanto el rendimiento cuántico como el coeficiente de extinción son específicos para cada fluoróforo y multiplicados juntos calculan el brillo de la molécula fluorescente. [5]
Etiquetado
Tintes reactivos
Los fluoróforos se pueden unir a proteínas a través de grupos funcionales específicos, como:
- grupos amino ( por ejemplo, mediante succinimida o isotiocianato );
- grupos carboxilo ( por ejemplo, mediante activación con carbodiimida y posterior acoplamiento con amina );
- tiol ( por ejemplo, a través de maleimida o yodoacetamidas);
- azida ( por ejemplo, mediante química de clic con alquino terminal );
o de forma no específica ( glutaraldehído ) o de forma no covalente ( por ejemplo, mediante hidrofobicidad , etc.).
Estos fluoróforos son moléculas pequeñas, proteínas o puntos cuánticos.
Los fluoróforos orgánicos emiten fluorescencia gracias a los electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida, por lo que la mayoría de los fluoróforos son sistemas conjugados . Varias familias salen y sus excitaciones van desde el infrarrojo al ultravioleta .
Lantánidos (quelado) son únicamente metales fluorescentes, que emiten gracias a las transiciones que implican 4 f órbitas, que están prohibidas, por lo tanto, tienen muy bajos coeficientes de absorción y las emisiones lento, requiriendo excitación a través orgánicos fluorescentes quelantes ( por ejemplo dipicolinato basados terbio (III) quelantes [6] ).
Una tercera clase de fluoróforo de molécula pequeña es la de los complejos de ligando de metal de transición , que muestran fluorescencia molecular desde un estado de transferencia de carga de metal a ligando que está parcialmente prohibido; estos son generalmente complejos de rutenio , renio u osmio .
Puntos cuánticos
Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .
Proteínas fluorescentes
Existen varias proteínas fluorescentes en la naturaleza [ cita requerida ] , pero la más importante como herramienta de investigación es la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria , [7] que presenta fluorescencia espontánea al plegarse a través de residuos específicos de serina-tirosina-glicina. El beneficio que la GFP y otras proteínas fluorescentes tienen sobre los tintes orgánicos o puntos cuánticos es que pueden expresarse exógenamente en células solas o como una proteína de fusión , una proteína que se crea ligando el gen fluorescente (p. Ej., GFP) a otro gen y cuya expresión es impulsada por un promotor genético interno u otro promotor específico. Este enfoque permite que las proteínas fluorescentes se utilicen como indicadores de cualquier número de eventos biológicos, como la localización subcelular y los patrones de expresión . Una variante de GFP se encuentra naturalmente en los corales , específicamente los Anthozoa , y se han creado varios mutantes para abarcar los espectros visibles y emitir fluorescencia durante más tiempo y de manera más estable. Otras proteínas son fluorescentes pero requieren un cofactor fluoróforo y, por lo tanto, solo pueden usarse in vitro ; estos se encuentran a menudo en plantas y algas (fitofluores, ficobiliproteína como la aloficocianina ).
Bioluminiscencia y fluorescencia
La fluorescencia , la quimioluminiscencia y la fosforescencia son 3 tipos diferentes de propiedades de luminiscencia , es decir, la emisión de luz de una sustancia. La fluorescencia es una propiedad en la que la luz se absorbe y se remite en unos pocos nanosegundos (aproximadamente 10 ns) a una energía más baja (= mayor longitud de onda), mientras que la bioluminiscencia es la quimioluminiscencia biológica , una propiedad en la que la luz se genera por una reacción química de una enzima en un sustrato. La fosforescencia es una propiedad de los materiales para absorber la luz y emitir la energía varios milisegundos o más después (debido a las transiciones prohibidas al estado fundamental de un estado triplete , mientras que la fluorescencia ocurre en estados excitados singlete ). Hasta hace poco no era aplicable a la investigación en ciencias de la vida debido al tamaño de las partículas inorgánicas. Sin embargo, el límite entre la fluorescencia y la fosforescencia no está limpio, ya que los complejos ligando de metales de transición , que combinan un metal y varios restos orgánicos, tienen una vida útil prolongada, hasta varios microsegundos (ya que muestran estados mixtos de singlete-triplete).
Comparación con la radiactividad
Antes de su uso generalizado en las últimas tres décadas, la radiactividad era la etiqueta más común.
Las ventajas de la fluorescencia sobre los marcadores radiactivos son las siguientes:
- La fluorescencia es más segura de usar y no requiere controles radiológicos.
- Se pueden usar varias moléculas fluorescentes simultáneamente dado que no se superponen, cf. FRET, mientras que con radiactividad se pueden usar dos isótopos ( tritio y un isótopo de baja energía como el 33 P debido a las diferentes intensidades) pero requieren maquinaria especial (una pantalla de tritio y una pantalla de imágenes de fósforo regular o un detector de dos canales específico [8] ).
Nota: un canal es similar al "color" pero distinto, es el par de filtros de excitación y emisión específicos para un tinte, por ejemplo, los microarrays de Agilent son de doble canal, funcionan en cy3 y cy5, estos se conocen coloquialmente como verde y rojo.
La fluorescencia no es necesariamente más conveniente de usar porque requiere un equipo de detección especializado propio. Para aplicaciones de cuantificación relativa o no cuantitativa, puede ser útil, pero no es adecuado para realizar mediciones absolutas debido a la extinción de la fluorescencia , mientras que la medición de moléculas marcadas radiactivamente es siempre directa y muy sensible.
Las desventajas de los fluoróforos incluyen:
- Cambia significativamente las propiedades de una molécula marcada con fluorescencia.
- Interferencia con los procesos biológicos normales.
- Toxicidad
Propiedades útiles adicionales
La propiedad básica de la fluorescencia se usa ampliamente, como un marcador de componentes marcados en las células ( microscopía de fluorescencia ) o como un indicador en solución ( espectroscopía de fluorescencia ), pero otras propiedades adicionales, que no se encuentran con la radioactividad, lo hacen aún más ampliamente utilizado.
PREOCUPARSE
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FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) es una propiedad en la que la energía del electrón excitado de un fluoróforo, llamado donante, se transmite a un tinte aceptor cercano, ya sea un atenuador oscuro u otro fluoróforo, que tiene un espectro de excitación que se superpone con el espectro de emisión del tinte donante dando como resultado una fluorescencia reducida. Esto se puede utilizar para:
- detectar si dos proteínas o ácidos nucleicos marcados entran en contacto o si se hidroliza una sola molécula doblemente marcada;
- detectar cambios en la conformación;
- medir la concentración mediante un ensayo de unión competitiva.
Sensibilidad al medio ambiente
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Los tintes sensibles al medio ambiente cambian sus propiedades (intensidad, vida media y espectros de excitación y emisión) dependiendo de la polaridad (hidrofobicidad y carga) de sus entornos. Los ejemplos incluyen: Indole , Cascade Yellow, prodan, Dansyl, Dapoxyl, NBD, PyMPO, Pyrene y dietilaminocumarin.
Este cambio es más pronunciado cuando los grupos donadores y receptores de electrones se colocan en extremos opuestos de un sistema de anillos aromáticos, [9] ya que esto da como resultado un gran cambio en el momento dipolar cuando se excitan.
Cuando se excita un fluoróforo, generalmente tiene un momento dipolar mayor (μ E ) que en el estado fundamental (μ G ). La absorción de un fotón por un fluoróforo tarda unos pocos picosegundos. Antes de que se libere esta energía (emisión: 1-10 ns), las moléculas de disolvente que rodean al fluoróforo se reorientan (10-100 ps) debido al cambio de polaridad en el estado singlete excitado; este proceso se llama relajación con solvente. Como resultado de esta relajación, la energía del estado excitado del fluoróforo se reduce (longitud de onda más larga), por lo tanto, los fluoróforos que tienen un gran cambio en el momento dipolar tienen cambios de desplazamiento de stokes más grandes en diferentes disolventes. La diferencia entre los niveles de energía se puede determinar aproximadamente con la ecuación de Lipper-Mataga.
Un tinte hidrófobo es un tinte que es insoluble en agua, una propiedad independiente del solvatocromismo.
Además, el término sensible al medio ambiente en química en realidad describe los cambios debidos a una variedad de factores ambientales diferentes, como el pH o la temperatura, no solo la polaridad; sin embargo, en bioquímica, el fluoróforo sensible al medio ambiente y el fluoróforo solvatocrómico se usan indistintamente: esta convención está tan extendida que los proveedores los describen como sensibles al medio ambiente en lugar de solvatocrómico.
Vida útil de la fluorescencia
Los restos fluorescentes emiten fotones varios nanosegundos después de la absorción siguiendo una curva de desintegración exponencial, que difiere entre los tintes y depende del disolvente circundante. Cuando el tinte se une a macromoléculas, la curva de desintegración se vuelve multiexponencial. Los tintes conjugados generalmente tienen una vida útil entre 1 y 10 ns, existe una pequeña cantidad de excepciones de vida más larga, en particular pireno con una vida útil de 400ns en disolventes desgasificados o 100ns en lípidos y coroneno con 200ns. En una categoría diferente de fluoróforos se encuentran los organometales fluorescentes (lantánidos y complejos de metal de transición-ligando) que se han descrito anteriormente , que tienen una vida útil mucho más larga debido a los estados restringidos: los lantánidos tienen una vida útil de 0,5 a 3 ms, mientras que el metal de transición-ligando los complejos tienen una vida útil de 10 ns a 10 µs. Tenga en cuenta que la vida útil de la fluorescencia no debe confundirse con la vida útil de la fotodestrucción o la "vida útil" de un tinte.
Excitación multifotónica
La excitación multifotónica es una forma de enfocar el plano de visión del microscopio aprovechando el fenómeno en el que dos fotones de baja energía simultáneos son absorbidos por una fracción fluorescente que normalmente absorbe un fotón con el doble de su energía individual: digamos dos fotones NIR (800 nm). para excitar un tinte UV (400 nm).
Anisotropía de fluorescencia
Un resto fluorescente perfectamente inmóvil cuando sale con luz polarizada emitirá luz que también está polarizada. Sin embargo, si una molécula se está moviendo, tenderá a "alterar" la polarización de la luz al irradiar en una dirección diferente a la de la luz incidente.
Métodos
- La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares se logra marcando un anticuerpo con un fluoróforo y permitiendo que el anticuerpo encuentre su antígeno diana dentro de la muestra. El etiquetado de múltiples anticuerpos con diferentes fluoróforos permite la visualización de múltiples objetivos dentro de una sola imagen.
- Secuenciación automatizada de ADN mediante el método de terminación de cadena ; cada una de las cuatro bases de terminación de cadena diferentes tiene su propia etiqueta fluorescente específica. A medida que se separan las moléculas de ADN marcadas, la etiqueta fluorescente se excita mediante una fuente de UV y la identidad de la base que termina la molécula se identifica por la longitud de onda de la luz emitida.
- Detección de ADN: el compuesto bromuro de etidio , cuando está libre para cambiar su conformación en solución, tiene muy poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio aumenta en gran medida cuando se une al ADN, por lo que este compuesto es muy útil para visualizar la ubicación de los fragmentos de ADN en la electroforesis en gel de agarosa . El bromuro de etidio puede ser tóxico; una alternativa supuestamente más segura es el tinte SYBR Green .
- La micromatriz de ADN .
- Inmunología: un anticuerpo tiene un grupo químico fluorescente unido, y los sitios (por ejemplo, en una muestra microscópica) donde el anticuerpo se ha unido se pueden ver, e incluso cuantificar, por la fluorescencia.
- FACS ( clasificación de células activadas por fluorescencia ).
- La termoforesis a microescala (MST) utiliza la fluorescencia como lectura para cuantificar el movimiento dirigido de biomoléculas en gradientes de temperatura microscópicos.
- La fluorescencia se ha utilizado para estudiar la estructura y conformaciones del ADN y las proteínas con técnicas como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , que mide la distancia a nivel angstrom. Esto es especialmente importante en complejos de múltiples biomoléculas.
- La fluorescencia se puede aplicar para estudiar la colocalización de diversas proteínas de interés. [10] Luego se puede analizar usando un software especializado, como CoLocalizer Pro .
Además, muchas moléculas biológicas tienen una fluorescencia intrínseca que a veces se puede usar sin la necesidad de unir una etiqueta química. A veces, esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un entorno específico, por lo que se puede medir la distribución o unión de la molécula. La bilirrubina , por ejemplo, es muy fluorescente cuando se une a un sitio específico en la albúmina sérica. La protoporfirina de zinc , formada en el desarrollo de glóbulos rojos en lugar de hemoglobina cuando no hay hierro disponible o plomo, tiene una fluorescencia brillante y puede usarse para detectar estos problemas.
El número de aplicaciones de fluorescencia en las ciencias biomédicas, biológicas y afines se expande continuamente. Los métodos de análisis en estos campos también están creciendo, a menudo con nomenclatura en forma de siglas como: FLIM , FLI, FLIP , CALI, FLIE, FRET , FRAP , FCS , PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP o TIRF . La mayoría de estas técnicas se basan en microscopios de fluorescencia, que utilizan fuentes de luz de alta intensidad, generalmente lámparas de mercurio o xenón, LED o láseres, para excitar la fluorescencia en las muestras bajo observación. Luego, los filtros ópticos separan la luz de excitación de la fluorescencia emitida para ser detectada por el ojo o con una cámara (CCD) u otro detector de luz (por ejemplo, tubos fotomultiplicadores, espectrógrafos). Se está realizando una investigación considerable para mejorar las capacidades de dichos microscopios, las sondas fluorescentes utilizadas y las aplicaciones a las que se aplican. De particular interés son los microscopios confocales, que utilizan un agujero de alfiler para lograr un corte óptico , lo que proporciona una vista cuantitativa en 3D de la muestra.
Ver también
- Fluoróforo
- Microscopía fluorescente
- Imágenes de fluorescencia
- Biosensores fluorescentes de glucosa
- Fluoroscopia
Referencias
- ^ Joseph R. Lakowicz (2006). Principios de la espectroscopia de fluorescencia . Saltador. págs. 26–. ISBN 978-0-387-31278-1. Consultado el 25 de junio de 2011 .
- ^ Fundamentos de fluorescencia . Invitrogen.com. Consultado el 25 de junio de 2011.
- ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Editores de ciencia de Bentham. ISBN 978-1-68108-519-7. Consultado el 17 de diciembre de 2017 .
- ^ Animación del principio de fluorescencia y absorbancia UV-visible
- ^ Au-Yeung, Ho Yu; Tong, Ka Yan (2021). "Capítulo 16. Metales de transición y sondas de imágenes en neurobiología y enfermedades neurodegenerativas". Iones metálicos en técnicas de bioimagen . Saltador. págs. 437–456. doi : 10.1515 / 9783110685701-022 .
- ^ Lamture, JB; Wensel, TG (1995). "Conjugados inmunorreactivos intensamente luminiscentes de proteínas y quelatos poliméricos de Tb (III) a base de dipicolinato". Química del bioconjugado . 6 (1): 88–92. doi : 10.1021 / bc00031a010 . PMID 7711110 .
- ^ Chalfie, M; Tu, Y; Euskirchen, G; Ward, WW; Prasher, DC (1994). "Proteína verde fluorescente como marcador de expresión génica". Ciencia . 263 (5148): 802–5. Bibcode : 1994Sci ... 263..802C . doi : 10.1126 / science.8303295 . PMID 8303295 .
- ^ "El Micro Imager de Biospace Lab" . Biospacelab.com . Archivado desde el original el 5 de enero de 2009 . Consultado el 25 de junio de 2011 .
- ^ Evanko, Daniel (2005). "Un fluoróforo 'escamoso' pero útil". Métodos de la naturaleza . 2 (3): 160–161. doi : 10.1038 / nmeth0305-160b .
- ^ Zinchuk, Grossenbacher-Zinchuk (2009). "Avances recientes en análisis cuantitativo de colocalización: enfoque en neurociencia". Prog Histochem Cytochem . 44 (3): 125-172. doi : 10.1016 / j.proghi.2009.03.001 . PMID 19822255 .