microscopio de fluorescencia
Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza fluorescencia en lugar de, o además de, dispersión , reflexión y atenuación o absorción , para estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas . [1] [2] "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que usa fluorescencia para generar una imagen, ya sea una configuración simple como un microscopio de epifluorescencia o un diseño más complicado como un microscopio confocal , que usa cortes ópticos para obtener mejor resolución de la imagen de fluorescencia. [3]
La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (o longitudes de onda) que es absorbida por los fluoróforos , lo que hace que emitan luz de longitudes de onda más largas (es decir, de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida mucho más débil mediante el uso de un filtro de emisión espectral. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son una fuente de luz ( la lámpara de arco de xenón o la lámpara de vapor de mercurio son comunes; las formas más avanzadas son los LED y láseres de alta potencia ), el filtro de excitación , el espejo dicroico (o divisor de haz dicroico) y elfiltro de emisión (ver la figura a continuación). Los filtros y el divisor de haz dicroico se eligen para que coincidan con las características de emisión y excitación espectral del fluoróforo utilizado para marcar la muestra. [1] De esta manera, la distribución de un solo fluoróforo (color) se refleja a la vez. Las imágenes multicolores de varios tipos de fluoróforos deben componerse combinando varias imágenes de un solo color. [1]
La mayoría de los microscopios de fluorescencia en uso son microscopios de epifluorescencia, donde la excitación del fluoróforo y la detección de la fluorescencia se realizan a través del mismo camino de luz (es decir, a través del objetivo). Estos microscopios se utilizan ampliamente en biología y son la base para diseños de microscopios más avanzados, como el microscopio confocal y el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los que se utilizan en las ciencias de la vida , tienen el diseño de epifluorescencia que se muestra en el diagrama. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través de la lente del objetivo . La fluorescencia emitida por el espécimen es enfocada al detector por el mismo objetivo que se utiliza para la excitación el cual para mayor resolución necesitará lentes objetivo con mayor apertura numérica. Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, solo la luz de excitación reflejada alcanza el objetivo junto con la luz emitida y, por lo tanto, el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal/ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro específico de longitud de onda, transmitiendo luz fluorescente a través del ocular o detector, pero reflejando cualquier luz de excitación restante hacia la fuente.
La microscopía de fluorescencia requiere una iluminación intensa, casi monocromática, que algunas fuentes de luz generalizadas, como las lámparas halógenas, no pueden proporcionar. [4] Se utilizan cuatro tipos principales de fuentes de luz, que incluyen lámparas de arco de xenón o lámparas de vapor de mercurio con un filtro de excitación , láseres , fuentes supercontinuas y LED de alta potencia . Los láseres se utilizan más ampliamente para técnicas de microscopía de fluorescencia más complejas, como la microscopía confocal y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, mientras que las lámparas de xenón, las lámparas de mercurio y los LED con dicroicoEl filtro de excitación se usa comúnmente para microscopios de epifluorescencia de campo amplio. Al colocar dos conjuntos de microlentes en la trayectoria de iluminación de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio, [5] se puede lograr una iluminación muy uniforme con un coeficiente de variación del 1-2 %.
Muestra superposiciones de cuatro canales fluorescentes
(b) Cian: [fluorescencia PLL-A546] - contratinción genérica para visualizar superficies de células eucariotas
(c) Azul: [fluorescencia Hoechst] - tiñe el ADN, identifica los núcleos
(d) Rojo: [autofluorescencia de la clorofila] - resuelve los cloroplastos [6]