Imágenes de calcio
La formación de imágenes de calcio es una técnica de microscopía para medir ópticamente el estado de calcio (Ca 2+ ) de una célula , tejido o medio aislado . Las imágenes de calcio se aprovechan de los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca 2+ mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). Esta técnica ha permitido estudios de la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos de células. En las neuronas, la actividad eléctrica siempre va acompañada de un influjo de Ca 2+iones. Por tanto, la formación de imágenes de calcio se puede utilizar para monitorizar la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos, lo que ha hecho posible diseccionar la función de los circuitos neuronales .
Los indicadores químicos son pequeñas moléculas que pueden quelar los iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo de EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad por iones de calcio (Ca 2+ ) versus iones de magnesio (Mg 2+ ).
Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , con el fin de hacer que la molécula sea lipófila y permitir una fácil entrada en la célula. Una vez que esta forma del indicador está en la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación del éster acetoximetílico) también se puede inyectar directamente en las células a través de un microelectrodo o micropipeta que elimina las incertidumbres en cuanto al compartimento celular que contiene el colorante (el éster acetoximetílico también puede ingresar al retículo endoplásmico y a las mitocondrias ). Unión de un Ca2+ ion a una molécula indicadora fluorescente conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia o al desplazamiento de la longitud de onda de emisión / excitación . Los indicadores fluorescentes químicos de Ca 2+ individuales se utilizan para las mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. Las primeras imágenes de Ca 2+ en tiempo real (velocidad de video) se llevaron a cabo en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de video intensificadas. [1] El desarrollo posterior de la técnica utilizando microscopios confocales de barrido láser reveló señales subcelulares de Ca 2+ en forma de chispas de Ca 2+ y Ca 2+blips. También se utilizaron respuestas relativas de una combinación de indicadores químicos fluorescentes de Ca 2+ para cuantificar los transitorios de calcio en orgánulos intracelulares como las mitocondrias . [2]
Las imágenes de calcio, también conocidas como mapeo de calcio, también se utilizan para realizar investigaciones sobre el tejido miocárdico. [3] El mapeo de calcio es una técnica ubicua que se utiliza en corazones enteros y aislados, como especies de ratones, ratas y conejos.
Los indicadores de calcio genéticamente codificables (GECI) son herramientas poderosas útiles para la obtención de imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. [4] < [5] [6] [7] Los GECI no necesitan cargarse en las celdas; en cambio, los genes que codifican estas proteínas pueden transfectarse fácilmente a líneas celulares. También es posible crear animales transgénicos que expresen el tinte en todas las células o selectivamente en ciertos subtipos celulares. Los GECI se han utilizado en los estudios de neuronas, [8] [9] células T , [10] cardiomiocitos , [11]etc. En términos generales, los GECI se pueden dividir en clases en las que la detección de calcio se basa en fluorescencia o luminiscencia; sin embargo, ambos dependen inevitablemente de proteínas fluorescentes como indicadores, incluida la proteína verde fluorescente GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).
